Name: Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin, mühendislik dendritik hücreleri kullanarak bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyonunu nasıl artıracağınızı. Bu yöntem, iltihaplı ortamlarda immünoterapi için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi tarafından Ödül No altında Peer Reviewed Tıbbi Araştırma Programı ile desteklenmiştir. W81XWH-15-1-0240 (XT). Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Savunma Bakanlığı tarafından mutlaka onaylanmaz. Bu çalışma aynı zamanda Kısmen Loma Linda Üniversitesi Tıp Bölümü (681207-2967 [XT ve GG], 681205-2967 [XT] ve 325491 [DJB] Araştırma Yenilik Hibetarafından desteklenmiştir.

Tüm in vivo hayvan çalışma protokolleri gözden geçirildi ve Loma Linda Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yanı sıra Hayvan Bakım ve Kullanım İnceleme Ofisi (ACURO) ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (USAMRMC) tarafından onaylandı Savunma Bakanlığı.
1. Hem 1α-hidroksilaz hem de RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virüs) ifade eden Lentivirüs hazırlanması
<ol><li>0. Gün: Sabahın erken saatlerinde CM-10-D hücre kültürü ortamında 293T hücrelerinin 5 x 105 hücre/mL'sini hazırlayın.</li>
	<li>150 mm x 25 mm kültür yemeklerinde tohum 20 mL/tabak. Kültür hücreleri 37 °C ve 5% CO2 24 h. Birleştirme için ~ 80-90% 24 saat sonra ulaşacaktır.</li>
	<li>1. Gün: 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl ve 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1) yapın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>2 M CaCl2 yapın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Her 150 mm x 25 mm kültür çanağı için steril 50 mL kültür tüpünde DNA çökeltme karışımı hazırlayın. İlk olarak, 2x HBS 1.620 μL, PMD2G 9.5 g (VSVG), 17.5 μg pCMVR8.74 (Capsid), Lenti-CYP-ALDH plazmid 27 μg (hem CYP27B1 ve ALDH1a2 taşıyan bir lentiviral vektör) ekleyin. İkinci olarak, H2O'yı 3,037,5 μL'lik son hacmine ekleyin.</li>
	<li>Son olarak, 202,5 μL 2 M CaCl2 damla ile çözeltiyi 1x HBS ve 125 mM CaCl2son konsantrasyonlarına karıştırArak ekleyin. CaCl2 eklenecek son olmalıdır. Transfeksiyon karışımlarını 20 dk oda sıcaklığında ara sıra karıştırılarak bekletin. Birden fazla 150 mm x 25 mm kültür yemekleri için, buna göre ölçeklendirin.</li>
	<li>3.240 μL DNA çökeltme karışımını 293T hücreleri içeren 150 mm x 25 mm kültür kabına damla ile ekleyin. DNA yağış karışımı nı eklerken kültür çanamasını yan yana hafifçe döndürün. Yemeği 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>2. Gün: Kalsiyum fosfat transfeksiyon çözeltisini çıkarın, 1x PBS ile hafifçe yıkayın ve hücre kültürünü CM-4-D hücre kültürü ortamıyla yeniden besleyin. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>3. Gün: Steril depolama şişelerinde süpernatantları hasat edin ve 4-8 °C'de saklayın. Taze CM-4-D hücre kültürü ortamı ile hücre kültürünü yeniler. Kültür 37 °C ve 5% CO2 başka bir 24 saat için hücreleri.</li>
	<li>4. Gün: Supernatants'ı steril saklama şişelerine topin. Supernatants'ı 3. VSVG psödotip virüsünü yoğunlaştırdık, süpernatanları santrifüj tüplere aktarın ve 4 °C'de 24 saat için 4.780 x g'de döndürün.</li>
	<li>Gün 5: Peletkapalı supernatants dökün (pelet genellikle görünür) ve tüpler birkaç dakika steril bir biyogüvenlik kabininde bir kağıt havlu üzerinde drenaj sağlar.</li>
	<li>% 5 gliserol içeren steril PBS ile pipetting tarafından peletre resuspend. Yeniden süspansiyon hacmi 150 mm x 25 mm kültür çanak başına 33,3 μL olacaktır.</li>
	<li>Aliquot 200 μL/tüp ve -80 °C'de saklayın. Titrasyon amacıyla 50 μL/şişeden ayrı bir aliquot yapın. Titers 108-109 transducing birimleri (TUs)/mL aralığında olmalıdır.</li>
	<li>Kültür yemekleri içine çamaşır suyu ekleyin ve onları atın. NOT: Tüm lentiviral elementler hücrelerde ifade edildikten sonra bu transfektif hücreler protokoldeki en büyük güvenlik sorunudur.</li>
</ol>2. Kemik İliği Türemiş DC'lerin (KBMK) Üretimi
<ol><li>4-5 Balb/c farelerinden kültürortamınıiçeren 50 mL steril polipropilen tüpe tibias ve femurhasat 6 .</li>
	<li>Tibias ve femurları kültür ortamını içeren 100 mm x 20 mm'lik bir kültür yemeğine aktarın. Diseksiyon makas ve forceps kullanarak tibias ve femurlar kasları gibi dokuları çıkarın.</li>
	<li>Kemik iliği boşluğunu ortaya çıkarmak için tibias ve femurların her iki ucunu kesin.</li>
	<li>30 G iğneye bağlı 10 mL şırıngada 10 mL kültür ortamı çizin.</li>
	<li>İğneyi kemik iliği boşluğuna dikkatlice yerleştirin ve kemik iliğini temiz bir 50 mL steril polipropilen tüpe boşaltın. Kemik iliğinin tamamen dışarı atıldığından emin olmak için gerekirse bu işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Pelet tarafından kemik iliği hücreleri santrifüj (400 x g) 2-8 °C 5 dk. Aspire supernatant.</li>
	<li>1x kırmızı kan hücresi lisis tampon 5 mL ile pelet resuspend.</li>
	<li>Ara sıra sallayarak 4-5 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>30 mL kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>5 dk. CM-10-R hücre kültürü ortamının 10 mL'sinde hücreleri 2-8 °C'de santrifüj (400 x g)ile peletleyin. Gerekirse, hücreler enkaz kaldırmak için 40 μm hücresüz geçilebilir.</li>
	<li>CM-10-R hücre kültür ortamını kullanarak hücre sayısını gerçekleştirin ve hücreleri 1 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.</li>
	<li>Rekombinant murine granülosit/makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF, son konsantrasyon = 100 U/mL) ve murine interlökin-4 (IL-4, son konsantrasyon = 10 U/mL) ekleyin. NOT: GM-CF ve IL-4'ün stok çözümleri sırasıyla -80 °C'de 100.000 U/mL (1.000 x) ve 10.000 U/mL (1.000x) olarak saklanır.</li>
	<li>Hücreleri 4 mL/kuyuda 6 kuyu kültür plakasına dağıtın ve 48 saat boyunca hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de kültüre alın.</li>
	<li>Yapışmaz hücreleri nazik pipetleme ile çıkarın.</li>
	<li>GM-CSF (100 U/mL) ve IL-4 (10 U/mL) içeren taze CM-10-R hücre kültürü ortamını ekleyin. Kültür başka bir 48 saat için hücreleri.</li>
	<li>Lenti-CYP-ALDH virüsü nün transdüksiyonu için yapışmayan hücreleri (KBM) hasat edin.</li>
</ol>3. DC-CYP-ALDH Hücreleri Üretmek için lenti-CYP-ALDH Virüsü ile DC'lerin Transdüksiyonu
<ol><li>50 μL virüs ve 8 μg/mL protamin içeren 0,5 mL CM-10-R hücre kültür ortamı hacminde toplam 1 x 106 DC/kuyu hazırlayın.</li>
	<li>37 °C ve %5 CO2'de 24 saat boyunca hücreleri kültürlendirin.</li>
	<li>Orta yı taze CM-10-R hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat daha pişirin. Bu noktada, 1α-hidroksilaz ve RALDH2 enzimatik faaliyetleri değerlendirilebilir (bkz. adım 4). Gerekirse, ikinci bir transdüksiyon için 3.1-3.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Lipopolisakkarit (100 ng/mL) ekleyin ve 24 saat boyunca hücreleri kültür.</li>
	<li>Deneyler için hücreleri (DC-CYP-ALDH hücreleri) hasat edin.</li>
</ol>4. DC-CYP-ALDH Hücrelerinde Aşırı Ifade Edilen 1α-hidroksilaz ve RALDH2'nin değerlendirilmesi
<ol><li>DC-CYP-ALDH hücrelerinde aşırı ifade edilen 1α-hidroksilaz değerlendirilmesi<ol>
<li>Tohum 1.0 x 106 DC-CYP-ALDH hücreleri/iyi CM-10-R hücre kültürü orta 2 mL içinde 12 kuyu kültür plakaları içine.</li>
		<li>2,5 μM'lik son konsantrasyona 25(OH)D ekleyin. DC-CYP-ALDH hücrelerini 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Supernatants hasat ve -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Ticari olarak kullanılabilen bir radyoimmünoassay (RIA) kullanarak süpernatantlarda 1,25(OH)2D konsantrasyonları için bir assay (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>DC-CYP-ALDH hücrelerindeki 1α-hidroksilaz ekspresyonunu floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile bir anti-CYP27B1 antikor kullanarak belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-CYP-ALDH hücrelerinde aşırı ifade edilen RALDH2'nin değerlendirilmesi NOT: Aşırı ifade edilen RALDH2'nin ekspresyonu ve aktivitesi ticari aldehit dehidrogenaz (ALDH) tespit kiti kullanılarak belirlenir (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Dc-CYP-ALDH veya kontrol hücrelerinin tohum 1 mL 'si (1 x 105 hücre/mL, test tamponu) her iki 5 mL'lik tüplerin her birinde (biri "Kontrol" olarak, diğeri ise "Test" olarak etiketlenmiştir).</li>
		<li>Kontrol tüplerinin her birine 10 μL dietilaminobenzaldehit (DEAB) çözeltisi (%95 etanolde 1,5 mM) ekleyin ve hemen karıştırın. DEAB bir RALDH2 inhibitörüdür.</li>
		<li>Kontrol ve Test tüplerine 5 μL aktif RALDH floresan substrat (300 μM) ekleyin ve hemen karıştırın.</li>
		<li>Tüpleri 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>400 x g'de 2-8 °C'de 5 dk. Aspiratörlere aspirasyon yaparak hücreleri peletleyin.</li>
		<li>200 μL'lik bir istinat arabelleğindeki hücreleri yeniden oluştur.</li>
		<li>Hücreleri buzda tutun ve FACS tarafından analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923578">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li>
<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20192811">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li>
<li>Clifford, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natalizumab-associated+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+patients+with+multiple+sclerosis%3A+lessons+from+28+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases.</a> Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).</li>
<li>Linda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+multifocal+leukoencephalopathy+after+natalizumab+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Generation+of+Gut-Homing+Regulatory+T+Cells+for+the+Suppression+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis.</a> Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cell memory.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).</li>
<li>Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+of+tolerance+and+induction+of+regulatory+T+cells+by+erythrocyte-targeted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens.</a> Science Report. 5, 15907(2015).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+inhibitory+activity+of+regulatory+T+cells+requires+the+transcription+factor+Helios%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios.</a> Science. 350 (6258), 334-339 (2015).</li>
<li>Bhela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plasticity+and+Stability+of+Regulatory+T+Cells+during+Viral-Induced+Inflammatory+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions.</a> Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).</li>
<li>Marek-Trzonkowska, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+type+1+diabetes+with+CD4%28%2B%29CD25%28high%29CD127-regulatory+T+cells+prolongs+survival+of+pancreatic+islets+-+results+of+one+year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up.</a> Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).</li>
<li>Desreumaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+antigen-specific+regulatory+T-cell+therapy+for+patients+with+refractory+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li>
<li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li>
<li>Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li>
<li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li>
<li>Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+ligation+by+flagellin+converts+tolerogenic+dendritic+cells+into+activating+antigen-presenting+cells+that+preferentially+induce+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses.</a> Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).</li>
<li>Danova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+p38+MAPK%2C+ERK1%2F2%2C+mTOR%2C+STAT3+and+increased+glycolysis+regulate+stability+of+paricalcitol%2Fdexamethasone-generated+tolerogenic+dendritic+cells+in+the+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment.</a> Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).</li>
<li>Liu, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+triggering+of+a+vitamin+D-mediated+human+antimicrobial+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response.</a> Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).</li>
<li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+vitamin+D+and+vitamin+D+analogs+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia.</a> Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).</li>
<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasting+Impact+of+Clostridium+difficile+Infection+in+Inflammatory+Bowel+Disease%3A+A+Propensity+Score+Matched+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis.</a> Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).</li>
<li>Tsai, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865(2015).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li>
<li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen%2C+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li>
<li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn%27s+Disease+in+Remission%3A+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Disease+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li>
<li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers%2C+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li>
<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Dr Xiaolei Tang ve David J. Baylink bekleyen bir patent bu çalışma ile ilgili mucitler vardır.

Bu makalede, dc-CYP-ALDH hücrelerinin kullanımı açıklanır, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırmak için. Verilerimiz DC-CYP-ALDH hücrelerinin sırasıyla 1,25(OH)2D ve RA in vitro yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda sentezleyebildiği gösterilmiştir (sırasıyla 25[OH]D ve retinol). 25(OH)D ve retinol yeterli kan konsantrasyonları kolayca eksikliği olan hastalarda sırasıyla D vitamini ve A takviyesi ile elde edilebilir çünkü30,<sup class="xr...

İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyer bozan kabul edilir1,2. Bu nedenle, şu anda mevcut ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı ilaçlar inflamatuar mediatörlerin işlevlerini inhibe veya bağırsak içine bağışıklık hücrelerinin homing engellemek. Ancak, inflamatuar mediatörler ve hedeflenen bağışıklık hücreleri de bağışıklık savunması için gereklidir. Sonuç olarak, inflamatuar arabulucu inhibitörleri sistemik bağışıklık savunma ve bağışıklık hücresi homing blokerler bağışıklık bağışıklık savunma zayıflatmak, her ikisi de ciddi sonuçlara yol açabilir3,4. Buna ek olarak, bağışıklık hücresi homing blokerler de bağırsak içine düzenleyici T homing engelleyebilir (Treg) hücreleri ve dolayısıyla IBD hastalarında zaten tehlikeye bağırsak bağışıklık toleransı kötüleştirebilir. Ayrıca, bağırsak içine Treg hücre homing engelleme de kanda Treg hücrelerinin birikimi nedeniyle sistemik bağışıklık baskılanmasına yol açabilir5. Son olarak, inhibitörler ve blokerler geçici olarak çalışır ve bu nedenle sık sık yönetimgerektirir. Bu inhibitörlerve blokerlerin sık uygulanması daha da istenmeyen yan etkileri şiddetlendirebilir.
Son zamanlarda, potansiyel olarak hafifletmek ve hatta IBD tedavisi için mevcut ilaçlar ile ilişkili yan etkileri ortadan kaldırmak yeni bir strateji önerdi6. Bu strateji periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artar6. Bu stratejinin mantığı gut-homing Treg hücreleri özellikle bağırsak ev ve dolayısıyla sistemik bağışıklık savunma ödün olmayacaktır. Buna ek olarak, Treg hücreleri potansiyel bellek oluşturabilir beri7,8, bağırsak-homing Treg hücreleri potansiyel IBD hastalarında kronik bağırsak iltihabı istikrarlı bir kontrol sağlayabilir ve, bu nedenle, tedavi sık sık uygulanması gerekmez. Ayrıca, bu strateji in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırır bu yana, in vitro oluşturulan Treg hücrelerinin benimseyen transferi ile ilişkili son derece proinflamatuar bir ortamda in vivo instabilite endişe yok9,10. Bu bağlamda, in vitro oluşturulan Treg hücreleri otoimmün hastalıkların tedavisi için önerilen stratejilerden biridir11,12,13 ve nakil reddi14,15. Son olarak, bu stratejide, dendritik hücreler (DCs) iki molekül de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanmış: aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA). Biz 1,25 (OH)2D ve RA seçti, çünkü 1,25(OH)2D düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu neden olabilir (örneğin, forkhead kutusu P3 [foxp3] ve interlökin-10 [IL-10])16,17 ve RA T hücrelerinde bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabilir18. Her iki 1.25 (OH)2D ve RA da DCs28,29tolere çünkü, biz mühendislik DC'ler stably vivo bir tolerojenik statüde muhafaza edilecek ve dolayısıyla in vitro tolerojenik DCs (TolDCs)19,20,21oluşturulan in vivo invivo instabilite endişeleri atlatmak neden . Bu bağlamda, TolDCs da Treg hücre fonksiyonları19,20,21in vivo büyütme için önerilen stratejilerden biridir. Bizim akıl desteklemek için, biz mühendislik DC'ler, in vivo teslim üzerine, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırabilirsiniz göstermiştir6.
Önerilen stratejimizin bir diğer avantajı da 1,25(OH)2D'nin IBD hastalarına fayda sağleyebilecek başka işlevlere sahip olmasıdır. Bu diğer fonksiyonlar antimikrobiyallerin salgılanmasını uyarmak için 1,25 (OH)2D yeteneği içerir22 ve karsinogenez bastırmak için23. Enfeksiyonlar ve kanserler sık lıkla IBD24,25ile ilişkilidir.
1,25(OH)2D ve RA de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretebilir DC'ler oluşturmak için, iki gen aşırı ifade etmek için DC'ler mühendislik için bir lentiviral vektör kullanın. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz (1α-hidroksilaz) kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya B üyesi 1 (CYP27B1) dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 (ALDH1a2) retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2 (RALDH2), fizyolojik RAsentezinikatalizler 6 .
Gut-homing Treg hücre indüksiyonunun in vivo arttırılması IBD tedavisinde potansiyel olarak önemli olduğundan, aşağıdaki protokolde 1α-hidroksilaz-RALDH2-aşırı ifade edici DC'lerin (DC-CYP-ALDH hücreleri) üretimi için prosedürleri ayrıntılı olarak açıklayacaktır. in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10 mL şırınga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat # 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm kültür kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu kültür plakaları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat # 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm kültür kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-hidroksikolekalsiferol (25 [OH] D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi #: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu kültür plakaları</td><td>ThermoFisher Bilimsel Kedi</td><td># 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri Kedi</td><td># 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam Kedi</td><td># ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D hücre kültürü ortamı</td><td></td><td></td><td>%10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/ml penisilin / streptomisin, 0.055 mM 2-merkaptoetanol (2-ME), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asit ve 2 mM L-glutamin.</td></tr><tr><td>%10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/ml penisilin/streptomisin, 0.055 mM 2-merkaptoetanol (2-ME), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asit ve 2 mM L-glutamin içeren CM-10-R hücre kültürü ortamı</td><td></td><td></td><td></td> RPMI 1640 ortamı (glutamin içermez).</tr><tr><td>% 4 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin / streptomisin, 0.055 mM 2-merkaptoetanol (2-ME), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asit ve 2 mM L-glutamin içeren</td> <td>CM-4-D hücre kültürü ortamı</td><td></td><td></td> DMEM ortamı.</tr><tr><td>Corning şişe üstü vakum filtreleri, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Corning şişe üstü vakum filtreleri, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi # 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>ThermoFisher Bilimsel Kedi</td><td># 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK parçalama tamponu</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi # A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # G5516</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG</td><td>Abcam</td><td>Kedi # ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Kedi</td><td># 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Özel yapım</td><td>1.6 kb fare CYP27B1 ve ALDH1a2 cDNA'ları, sırasıyla CYP27B1 cDNA'sını içeren bir plazmit ve ALDH1a2 cDNA'sını içeren bir plazmit kullanılarak PCR ile amplifiye edildi (GeneCopoeia). 5' KOZAK ribozom giriş dizisine sahip amplifiye edilmiş CYP27B1 cDNA fragmanı, pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vektörüne (Addgene) klonlandı. Ortaya çıkan yapı lenti-CYP-GFP olarak belirlenmiştir. Amplifiye edilmiş ALDH1a2 cDNA fragmanı, GFP'nin yerini almak için lenti-CYP-GFP'ye klonlandı ve lenti-CYP-ALDH olarak adlandırıldı. Bu bisiztronik plazmit, SFFV promotörü tarafından kontrol edilen CYP27B1 ve PGK promotörü tarafından kontrol edilen ALDH1a2'yi eksprese eder.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>ThermoFisher Bilimsel Kedi</td><td># 25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # L3755</td><td></td></tr><tr><td>Murin GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Kedi # 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Kedi # 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # S9888</td><td></td></tr><tr><td>İğneler</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi # 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>ThermoFisher Bilimsel Kedi</td><td>#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plazmid # 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>ThermoFisher Bilimsel Kedi</td><td># 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Dengeli Çözelti ( PBS)</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi #: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plazmid # 12259</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen tüp, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat # AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen tüp, 50 mL</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>Kedi # AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # P3369</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonkal IgG izotip kontrolü</td><td>Abcam</td><td>Cat # ab171870</td><td></td></tr><tr><td>1,25 (OH) 2D ölçümü için Radioimmunoassay</td><td>Heartland Testleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta, glutamin yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat # 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat #: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Steril Hücreli süzgeçler, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Steril saklama şişeleri, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

bağırsak-homing düzenleyici t hücre İndüksiyon in vivo augmentation

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyeri bozar kabul edilir. Biz son zamanlarda gut-homing düzenleyici T (Treg) hücreleri IBD için umut verici bir tedavi olduğunu göstermektedir. Buna göre, bu makalede gut-homing Treg hücre indüksiyon in vivo büyütme için bir protokol sunar. Bu protokolde, dendritik hücreler iki molekül de novo, aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır. 1,25(OH)2D ve RA'yı, 1,25(OH)2D'nin düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu (örneğin, çatal kafa kutusu P3 ve interlökin-10) ve RA'nın T hücrelerindeki bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabileceğini gösteren önceki bulgulara dayanarak seçtik. Bu tür mühendislik dendritik hücreleri oluşturmak için, dendritik hücreleri iki geni aşırı eksprese etmek için vermek için lentiviral vektör kullanıyoruz. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya 1'dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2, fizyolojik RA sentezini katalizler. Bu protokol in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.

DC-CYP-ALDH hücreleri 1α-hidroksilaz miktarının önemli ölçüde arttığını ifade etti. KBM'lerden üretilen DC-CYP-ALDH hücrelerinin 1α-hidroksilaz miktarını önemli ölçüde ifade edip etmediğini belirlemek için, KBM'ler lenti-CYP-ALDH virüsü ile kemik iliği kaynaklı DC-CYP-ALDH hücreleri (BMDC-CYP-ALDH hücreleri) üretmek için transe geçirildi. Daha sonra, BMDC-CYP-ALDH hücreleri FACS tarafından 1α-hidroksilaz ekspresyonu için incelendi. Verilerimiz, BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin ebeveyn KBM'leri ile karşılaştırı...

Burada bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyon invivo büyütme için bir protokol sıyoruz. Bu protokolde, dendritik hücreler lokal olarak aktif D vitamini (1,25-dihidroksivitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) de novo yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır.

Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Bu protokol, insan uygulamaları için kolayca değiştirilebilen potansiyel olarak yeni bir tedavi stratejisini açıklamaktadır. Bu teknik doğrudan periferik lenfoid dokularda bağırsak-homing düzenleyici T hücrelerinin indüksiyon artırır ve stably son derece pro-inflamatuar ortamlarda bile uygulanabilir. Bu teknikler aynı zamanda periferik bağışıklık sistemi içinde aktif D vitamini ve A vitamini rolünü araştırmak için kullanılabilir.Bu görsel gösteri, bu tekniğin başarısı için kritik olan yüksek kaliteli mühendislik dendritik hücrelerin üretimi için adım adım talimatlar sağlayacaktır. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saat kuluçka için 150 cm-10-D hücre kültürü orta 20 mililitre yedi 293T hücreleri bir kez 10 tohumlama ile başlayın. Ertesi gün, taze hazırlanmış iki kat konsantre HBS çözeltisi 1.62 mililitre ekleyin, zarf plazmid 9.5 mikrogram, ambalaj plazmid 17.5 mikrogram, ve 50 mililitrelik konik tüp LENTI-CYP-ALDH plazmid 27 mikrogram.Tüp içeriğinin son hacmini 3,0375 mililitreye kadar su ile getirin ve ardından iki azı dişi kalsiyum klorür 202,5 mikrolitre ilave edin. 293T kültürüne 3,24 mililitre çözelti eklemeden önce, kabı hafifçe döndürerek 20 dakika oda sıcaklığında

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Öğrenin, mühendislik dendritik hücreleri kullanarak bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyonunu nasıl artıracağınızı. Bu yöntem, iltihaplı ortamlarda immünoterapi için uygundur.

Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation

Daha fazla video keşfet