Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Bu protokol, biyolojik fonksiyonlarla ilgili kolektif membran dalgalanmalarının ve lipid zarlarının pratik uygulamalarının başarılı nötron spin eko çalışmaları için gerekli numune hazırlama ve veri azaltmayı açıklar. NSE, diğer tekniklerle erişilemeyen seçici membran özelliklerinin yoklatılmasında izotop hassasiyetinin benzersiz avantajı ile anahtar membran fonksiyonlarının nanosaniye zaman ölçeklerindeki membran dinamiklerine doğrudan erişmektedir. Nano ölçekteki membran dinamiklerinin çalışmaları, moleküler mekanizmanın temel membran özelliklerini ve çeşitli hücre patolojilerine karışan membran-protein etkileşimlerini anlamak için gereklidir.

Yöntem, NSE'ye yeni araştırmacılara, başarılı deneyler ve sonraki veri azaltma analizi ve yorumu için lipid veziklin tasarımı, hazırlanması ve karakterizasyonunda ayrıntılı yönergeler sağlar. Prosedürü gösterenler teshani Kumarage ve julie Nguyen, yüksek lisans öğrencisi ve laboratuvardan bir lisans öğrencisi olacak. Bir davlumbazın içinde çalışarak, doğru tartılmış lipitleri manuel karıştırma ile bir mililitre solvent içinde çözerek lipid süspansiyonunu hazırlayın.

Lipid çözeltisini yavaşça bir açıyla döndürürken şişeye inert bir gaz akışı yaparak kurutun. Artık çözücüyü iyice çıkarmak için şişeleri bir gecede 35 santigrat derecede bir vakum fırınına yerleştirin. Ertesi gün, mililitre başına 50 miligram lipit konsantrasyonu elde etmek için lipid filmini iki mililitre ağır su ile nemlendirin ve lipid filmi tamamen çözünene kadar hidratlı lipid süspansiyonunu girdaplayın.

Daha sonra, hidratlı lipit süspansiyon şişesini donana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayarak beş donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin. Ve sonra lipid süspansiyonu eritmek için 35 santigrat derecelik bir su banyosuna aktarıyor. Bir sonraki döngüye geçmeden önce homojen olana kadar çözülen süspansiyonu girdap.

Deneye başlamadan önce, ekstrüder kurulumunu iki membran desteği arasında bir poli-bikarbonat membran kullanarak monte edin ve ek destek sağlamak için her iki tarafa iki kağıt filtre ekleyin. 0,3 mililitre ağır suyu zar tertibatından birkaç kez geçirerek polikarbonat membranı nemlendirmek için hava geçirmez cam şırınnalar kullanın. Zarı nemlendirdikten sonra, bir ucuna hazırlanmış süt beyazı renkli lipit çözeltisi ve ekstrüder aparatının karşı ucuna boş bir şırınna ile bir mililitre gaz geçirmez şırınna yerleştirin.

Şırındlar bağlandıktan sonra montajı ekstrüder bloğuna yerleştirin. Ekstrüzyon oranını girmek için Hız düğmesini basılı tutarak pompayı programlayın ve şırınna çapını girmek için Çap düğmesine basın. Ardından, ışık yanana kadar Geri Çek'e basın.

Başla tuşuna basın ve numunenin boş şırınna dağıtmaya başlamasını bekleyin. Örnek şırınna tamamen boş olmadan hemen önce Durdur düğmesine basın. Dağıtılan ses seviyesini kaydedin, ardından ekranda birinci aşama görünene kadar Hız düğmesini basılı tutun.

Geri çek ışığını kapalı tutarak, daha önce kaydedilen dağıtılmış ses düzeyini girmek için ses seviyesi düğmesine basın. Hız düğmesine tekrar basın ve ikinci aşamaya erişmek için sağ en yukarı oku kullanın. Daha önce kaydedilen dağıtılmış birimin aynı değerini girmek için ses seviyesine basın.

Bu aşamada, Geri Çek ışığı yanana kadar Geri Çek düğmesine basın. LP:SE ekranda görünene kadar ses seviyesi düğmesine basarak üçüncü aşama döngüsünü tekrarlayın ve 20 olarak ayarlayın. Son olarak, Pompa kurulumunu bitirmek için Durdur işlevine ulaşmak için Hız düğmesine, dördüncü aşamaya erişin ve ses seviyesi düğmesine basın.

Pompa program edildikten sonra, ekstrüzyon döngüsüne başlamak için Başlat'a basın. Şeffaf opal mavi ekstrüde lipid süspansiyonunu ölçümler için temiz bir şişede toplamadan önce 15 ila 20 ekstrüzyon döngüsü gerçekleştirin. DAVE yazılımını açın ve Veri Azaltma menüsünden NSE verilerini azalt'ı seçin.

Dosya menüsünden Yankı Dosyalarını Aç'ı kullanarak veri dosyalarını farklı Q değerleri üzerinden yükleyin. Yüklenen dosyalar kullanılabilir veri kümeleri altında görünecektir. Seçili dosyaya sağ tıklayın ve Örnek, Hücre veya Çözünürlük gibi karşılık geldiği ölçüme göre etiketleyin.

Veri Kümesi sekmesini kullanarak, sinyalin gürültü oranına oranını iyileştirmek için dedektör piksellerini 2 X 2'de gruplandırın. Çözünürlük, Hücre ve Örnek'in tüm dosyalarına aynı depo gözünü uygulayın. Tüm piksel grupları üzerindeki verileri inceleyin ve klavyedeki Bitiş tuşuna basarak sinyalleri zayıf olanları maskele.

Aynı maskeyi dört kez de uygulamak için açılır pencereye erişmek için Enter tuşuna basın. Maskelenmiş pikseller yeşile döner. Toplanan verilerin yankı sinyali şeklinde olduğundan emin olun.

İstediğiniz dosyaya sağ tıklayarak ve açılır menüden İşlemleri Sığdır, Yankılara Sığdır'ı seçerek çözünürlük dosyasını karşıya yüklenen dosya listesinden takmaya başlayın. Yankı sinyallerinin sığmasının makul montaj parametreleri sağladığından emin olun. Tüm dedektör üzerindeki her bağlantı parametresiyle ilişkili hatayı incelemek için Görüntü Seçenekleri'ni seçin ve ardından ilgili bağlantı parametresini seçin.

Ardından, hata çubuğu haritasını gösteren bir açılır pencereye erişmek için dedektör görüntüsüne sağ tıklayın. Belirli bir pikselin üzerine sığdırma tatmin edici değilse, sinyali seçerek, Sığdır sekmesine basarak ve ardından Piksel Sığdır'a basarak bu pikselin üzerine yeniden takın. Sığdır sekmesinde aşama ve dönem için yeni başlangıç parametreleri girin.

Karşıya yüklenen ve etiketlenen dosya listesinden ilgili dosyayı seçerek örnek dosyayı azaltın. Tüm pikselleri inceleyin ve yukarıda açıklandığı gibi zayıf olanları maskeleyin. Ardından, dosyaya sağ tıklayın ve İşlemleri Sığdır, Aşamaları İçe Aktar'ı seçin.

Çözünürlük dosyası için, yankı sinyallerini daha önce açıklandığı gibi dönemin değerleri değişmeden sığdırın ve çözünürlükten içe aktarılan yankı faz noktası sığar. Genel sekmesine erişerek ve denemeden kaydedilen X ve Y ışın merkezi değerlerini girerek tüm veri dosyaları için ışın merkezini girin. Uyum tamamlandıktan sonra, takılan dosyalar listesinden istediğiniz örnek dosyaya tıklayarak ve açılır menüden Q'nun I'sini Hesapla'yı seçerek normalleştirilmiş ara saçılma işlevini hesaplayın.

Çözünürlük ve hücre dosyaları için gerekli bilgileri ve açılır penceredeki Q yaylarının sayısını girin, sonra sonuçları görüntülemek için Tamam'a basın. Siyandaki verilerin dedektör kenar efektleri nedeniyle zayıf bir sinyal gösterdiğine ve farklı Q veri kümeleri derlendiğinde ortadan kaldırılması gerektiğine dikkat edin. Son olarak, azaltılmış veri kümelerini ASCII dosyaları olarak kaydedin ve tüm oturumu istenen klasöre bir DAVE projesi olarak kaydedin.

Bu çalışmada farklı döterasyon şemaları ile hazırlanan lipozomal örneklerin NSE ölçümleri yapılmıştır. Membran bükme dalgalanmalarının NSE ölçümleri tam kontrastlı lipozomlar üzerinde gerçekleştirilir. Bu döterasyon şeması, membran çekirdeği ile döterlenmiş sıvı ortamı arasında büyük bir saçılma uzunluğu farkı ile sonuçlanır, lipozomal zarlardan gelen saçılma sinyalini önemli ölçüde artırır ve bükme dinamiklerinin ölçüm istatistiklerini iyileştirir.

Öte yandan, lipozomların membran kalınlığı dalgalanmalarının NSE ölçümleri, Q'ya göre bükülme dalgalanmalarının üçüncü bağımlılığına göre sapmalar göstermektedir. Kalınlık dalgalanma sinyalini izole etmek için, elde edilen sinyal Q'ya üçüncüye bölünür ve fazla dinamikler Q'daki bir Lorentzian işlevine monte edilir.Bu yöntem, yüksek konsantrasyon örnekleri ve güçlü saçılma sinyalleri ile daha ulaşılabilir olan kaliteli verilere dayar. NSE tarafından araştırılan dinamikler, moleküler lipit yapılarının ve ambalaj motiflerinin membran işlevlerini nasıl etkilediğini göstermek için döteryum NMR gevşeyicilik ve moleküler-dinamik simülasyonlar tarafından sinerjik olarak araştırılabilir.

Lipid zarları üzerine yapılan NSE çalışmaları membran biyofiziği, membran yapısı ve dinamiklerinin karmaşık ilişkileri ve membran fonksiyonlarını ve membran-protein etkileşimlerini nasıl etkilediğine yeni bir ışık tutmaktadır.