Merkezi Sinir Sistemi Üzerine In Vivo Remiyelinasyon Araştırması için Ozmotik Pompa Bazlı İlaç Dağıtımı

Demiyelinasyon çoklu santral sinir sistemi hastalıklarında görülür. Remiyelinizan ilaç testi için güvenilir bir in vivo ilaç dağıtım tekniği gereklidir. Bu protokol, uzun süreli ilacın doğrudan beyin parankimine verilmesine izin veren ve remiyelinasyon araştırmalarında geniş bir uygulama ile ilaç biyoyararlanımını geliştiren ozmotik pompa bazlı bir yöntemi tanımlamaktadır.

Ozmotik pompa, miyelin rejenerasyonunun araştırılması için, özellikle kısa bir yarı ömre sahip ilaçlar, zayıf kan-beyin bariyeri geçirgenliği ve çeşitli periferik yan etkileri olan ilaçlar için büyük bir değere sahiptir. Ozmotik pompa, kan-beyin bariyerini atlayabilir ve ilaçları doğrudan korpus kallozuma iletebilir, bu da özellikle kısa bir yarı ömre sahip bazı ilaçlar için ilaçların biyoyararlanımını etkili bir şekilde geliştirir. Başlamak için, anestezi uygulanmış bir farenin kafasını stereotaksik aparata bir diş çubuğu ve kulak çubukları ile sabitleyin.

Ameliyat bölgesi dışında hayvan vücudunu örtün. Bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için boynun tabanından gözlerin arasına kadar cildin bir santimetre uzunluğunda bir orta sagital kesisini yapın. % 30 hidrojen peroksit içeren bir pamuklu çubuk kullanarak, kafatası yapılarını görselleştirmek için kafatasının yüzeyini nazikçe silin.

Lambda noktasını ve bregma noktasını aynı yüksekliğe yerleştirmek için diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın. 10 mikrolitrelik ve 33 gauge şırınga iğnesinin ucunu yavaşça bregma noktasına yerleştirin ve X, Y ve Z koordinatlarını sıfırlayın. Şırıngayı enjeksiyon bölgesine taşıyın.

Bir mikrolitre 26 gauge ve 0.45 milimetre şırınga iğnesi ile duraya nüfuz etmeden enjeksiyon bölgesinde kafatasından yavaşça küçük bir çapak deliği açın. Mikrolitre şırınga iğnesini belirli bir derinliğe ulaşana kadar delikten yavaşça beyin dokusuna yerleştirin. Dakikada 0.5 mikrolitre hızında 1.5 mikrolitre% 1lisolesithin enjekte edin.

Şırıngayı çıkarmadan önce beş dakika bekleyin ve cildi 5-0 cerrahi dikişle dikin. Ameliyat olan fareyi tek başına bir kafese yerleştirin ve ameliyattan sonra fareyi günlük olarak izleyin. Kallozuma yakın 1,5 milimetrelik bir enjeksiyon derinliği elde etmek için doku yapıştırıcısı ile beyin infüzyon kanülünün iğnesine üç derinlik ayar aralayıcısı takın.

Şırınga iğnesini bir pompa paketiyle bir mililitrelik bir şırıngaya takarak ozmotik pompayı doldurun ve ilacı aspire edin. Pompayı dik konumda tutun. Şırıngayı pompanın üstündeki açıklığa yerleştirin ve bir hava kabarcığı oluşturmadan ilacı yavaşça enjekte edin.

Sıvı açıklıktan akarken şırıngayı yavaşça çekin. Makas veya pense kullanarak, beyaz flanşı akış regülatöründen çıkarın. Akış moderatörünü pompaya takın.

Ozmotik pompada kabarcıklar olup olmadığını belirlemek için, ozmotik pompayı doldurmadan önce ve sonra ayrı ayrı tartın. Kateteri hayvanın büyüklüğüne göre istenen uzunluğa kesin. Kateteri beyin infüzyon kanülüne takın.

Kateteri, hava vermeden şırıngayı kullanarak ilaçlarla doldurun. Kateteri, açıkta kalan akış moderatörünün yaklaşık dört milimetresini kapsayacak şekilde akış moderatörüne bağlayın. Doldurulmuş pompaları en az dört ila altı saat boyunca 37 santigrat derecede steril% 0,9 tuzlu veya PBS'ye batırın.

Uygulamadan sonra bir gecede uzatmayı tercih edin. Fareleri stereotaksik aparatın üzerine tekrar sabitleyin. Daha önce dikilmiş cerrahi kesiyi açın ve kesiyi omuz bıçaklarına kadar genişletin.

Cildi kürek kemiğindeki deri altı bağ dokusundan ayırın, bir boşluğu açmak için hemostatik pense veya cımbız kullanın ve ozmotik pompayı boşluğa yerleştirin. Bir pamuklu çubukla, demiyelinizasyon modelini oluştururken oluşturulan kafatasının yüzeyindeki pim deliğini nazikçe silin ve açığa çıkarın. Beyin infüzyon kanülünü iğne deliğinden dik olarak yerleştirin ve doku yapıştırıcısı ile kafatasına sabitleyin.

Beyin infüzyon kanülünün üzerindeki çıkarılabilir tırnağı bir çift makasla çıkarın. Kesini dikin veya doku yapıştırıcısı ile takın. Ameliyattan sonra hayvanı tek başına bir kafese yerleştirin.

Uygulama yapıldıktan sonra DAPI boyaması, beyin dokusundaki iğne deliğinin beyaz maddenin hemen üzerinde olduğunu ve ozmotik pompanın beyin infüzyon kanülünün başarılı bir şekilde uygulandığını ortaya koydu. In situ hibridizasyon deneyi, yeni farklılaşmış oligodendrositleri etiketlemek için olgun oligodendrosit işaretleyici MAG probu ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, UM206 tedavisinin demiyelinizli bölgede kontrol grubundan daha fazla MAG pozitif hücre verdiğini göstermiştir.

Demiyelinli bölgenin transmisyon elektron mikroskopisi, UM206 tedavi grubunda miyelinli akson sayısının kontrol grubuna kıyasla arttığını gösterdi ve bu da UM206'nın daha yüksek bir yeniden miyelinizasyon seviyesine neden olduğunu düşündürdü. Ozmotik pompayı hazırlarken, sisteme herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin.