Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Retinal araştırmalardaki zorluklardan biri, retinal nöronlar, glial hücreler ve vasküler hücreler gibi farklı hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemektir. Özellikle, retinal nöronların izole edilmesi ve kültürlenmesi zordur. Kültürlü retinal eksplantın bu sınırlamanın üstesinden gelebileceğine ve farklı retinal hücreler arasındaki çapraz etkileşimi, iyi kontrol edilen biyokimyasal parametreler altında ve vasküler sistemden bağımsız olarak incelememize izin veren benzersiz bir ex vivo sistem sunabileceğine inanıyoruz.

Ayrıca, retina eksplantı, vasküler ve nöronal yaralanma ile karakterize diyabetik retinopati gibi çeşitli retinovasküler ve nörodejeneratif hastalıklarda yeni farmakolojik müdahaleleri incelemek için önemli bir tarama aracıdır. Laboratuvarımız yıllardır mikrovasküler retinal disfonksiyonu teşvik eden patofizyolojik değişiklikleri incelemektedir. Hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere çok çeşitli modeller kullanmak, laboratuvarımızda birçok tekniği optimize etmemizi sağladı.

Burada, iki hafta boyunca kültürde tutulabilen vahşi tip yetişkin bir fareden türetilen retinal eksplantlar için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Hayvanları sabit sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda barındırın. Her hayvanı sağlık, yeterli yiyecek ve su açısından kontrol edin.

Hayvanlara taze yiyecek ve temiz su sağladığınızdan emin olun. Kirlenmiş kafesleri günlük olarak veya hayvanların sağlığı için gerektiği şekilde değiştirin. 12 haftalıktan daha eski erkek siyah 6 fare kullanın.

Ev kafeslerindeki hayvanları karbondioksit doz aşımı inhalasyonu ile ötenazileştirin. Prosedürü tamamladıktan sonra, hayvan ölümünü kalp ve solunum durmasını doğrulamak veya hayvanın sabit ve genişlemiş gözbebeklerini gözlemlemek gibi uygun bir yöntemle onaylayın. Servikal çıkık gibi ikincil bir ötenazi yöntemiyle ölüm doğrulamasını takip edin.

Dünya çıkıntı yapana kadar kavisli forseps kullanarak yörüngeye basınç uygulayın. Forsepsleri gözün arka kısmındaki nazikçe kapatın ve sürekli bir hareketle yükseltin. Göz küresini bir mililitrelik buz gibi soğuk HBSS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe batırın.

Göz küresini tam ortam içeren 1,5 veya iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Şimdi diseksiyon için hazır. Bu diyagramda, retinal eksplantı oluşturmak için fare göz küresinin diseksiyonu için gösterilecek ardışık adımlar gösterilmektedir.

Göz küresini açmak için limbüs boyunca çevresel kesi yapılır. Kornea limbal insizyon boyunca diseksiyon yoluyla çıkarılır. Lens ve vitreus daha sonra çıkarılır ve boş bir vizör adaptörü bırakılır.

Optik sinir başı bölgesinin ince forsepslerle tutulmasıyla, gözün dış kaplamasının soyulması nazikçe gerçekleştirilir. Nöral retinaya zarar vermemek ve retinayı tamamen sağlam tutmak için dış kaplamanın çıkarılması sırasında büyük dikkat. Daha sonra, retina daha küçük parçalara ayrılacaktır.

Bu büyük bir avantaj olacaktır, çünkü kontrol grubunuzun ve deney gruplarınızın aynı hayvandan türetildiği bir deney yapmanıza izin verecektir. Bununla birlikte, retinayı küçük parçalara ayırmak, daha zor olması için kullanımını sağlayacaktır. Bu nedenle, retina kültürünün doğru yönlendirilmesini sağlamak için bu küçük retina parçalarını işlemek için bir teknik geliştirdik.

Diseksiyon makas bıçağı retina parçasının hemen altında açık olarak gidin. Retina parçasını açık bir makas bıçağının ucuyla yavaşça yükseltin ve yavaşça kültür plakasına aktarın. Eksplantlar, her biri nöral retina tarafı yukarı bakacak şekilde 300 mikrolitre retinal eksplant ortamı içeren çok kuyucuklu plakalardaki hücre kültürü ekzerlerine ayrı ayrı aktarılacaktır.

Retinal eksplant kültürleri nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte muhafaza edilecektir. Retina yüzeyinin yukarı baktığından emin olun. Retina parçası çevrilirse veya katlanırsa, yavaşça doğru yöne ayarlamaya çalışın.

Retinal eksplantın nöral retina yukarı bakacak şekilde doğru yöne yerleştirilmemesi, retina hücrelerinin kültürde düzgün bir şekilde büyümemesine neden olacaktır. Burada, iki hafta boyunca kültürde boyanmış retinal eksplantların immünofloresan boyamasını görebiliriz. Eksplantlar retinal nöronlar için NeuN, glial hücreler için GFAP ve kan damarları için lektin ile sabitlendi ve boyandı.

Boyama iyi gelişmiş retina hücreleri ve retina damarları gösterdi. Burada, glial hücreler için GFAP ve kan damarları için lektin ile sabitlenmiş ve boyanmış retinal eksplantların immünofloresan boyamasını görebiliriz. Görüntüler, hem retina hücrelerinin hem de retina damarlarının kusurlu boyandığını ve az geliştiğini göstermektedir.

Bunun nedeni, retinal eksplantın katlanması ve kültür plakasına doğru yönlendirilmemesidir. Retina yukarı bakacak şekilde eksplantın doğru yönlendirilmesine büyük dikkat gösterilmelidir. Kontrol grubunun, tedavi edilen grupla aynı tek hayvandan türetilmiş olması, farklı deney koşullarının daha güvenilir bir şekilde karşılaştırılmasını büyük avantaj sağlar.

Retinal implantlar, diyabetik retinopati ve dejeneratif retina hastalıkları gibi çok çeşitli retina hastalıkları için olası terapötik hedefleri araştırmak için iyi bir platform sağlayabilir.