Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi
March 17th, 2023
Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.
Bu teknik, nöronlarda kalsiyum kullanımı hakkındaki anlayışımızı ve bölümlere ayrılmış kalsiyumun in vivo nöronal fonksiyon için önemli olan farklı mekanizmaları nasıl düzenleyebileceğini anlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, C.elegans'ta fizyolojik koşullar altında diğer floresan aletlerle kombine edilebilen daha yüksek çözünürlüklü hızlı in vivo görüntülemeye izin vermesidir. Bu teknik, birçok farklı bağlamda nöronlarda kalsiyum sinyallemesini düzenleyen mekanizma hakkında fikir verebilir.
Örneğin, yaşlanma, nöronal yaralanma ve nörodejenerasyon sırasında. Bu prosedürü gösteren araştırma teknisyeni Ennis Deihl olacaktır. Doktora adayı Kaz Knight ve laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Rachel Doser.
Bir promotör içeren ekspresyon vektörlerini klonlayarak başlayın, ardından bir kalsiyum göstergesi ve üç asal UTR tercih edin. Kalsiyum göstergesi transgenindeki kurtarma DNA'sı Lin-15 plus'ı içeren bir DNA karışımının bir günlük yetişkin C.elegans'ın gonadına mikroenjeksiyonu ile transgenik C.elegans suşları oluşturun. Enjekte edilen ebeveyn solucanları, F1 soyu yetişkinliğe ulaşana kadar 20 santigrat derecede tutun.
Multi-vulva fenotipinin yokluğunu tarayarak transgenik yetişkinleri seçin. Bu, kalsiyum göstergesini içeren ekstra kromozomal dizinin ekspresyonunu gösterir. Multi-vulva fenotipine sahip olmayan yetişkin F1 soyundan klonal olarak geçer.
Kalsiyum göstergesinin optimal bir ifadesi ile transgenik suşların sonraki nesilleri üzerinde deneyler yapın. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme yapabilen bir mikroskop kullanın. Solucanı düşük büyütme hedefi altında bulun ve ardından nöronları lokalize etmek için yüksek büyütme hedefine geçin.
50 FPS'den daha yüksek hızlarda hızlı görüntü yakalama yeteneğine sahip ultra hassas bir kamera kullanarak görüntüleri elde edin. Ardından, kalsiyum göstergesi için standart bir emisyon filtresi kullanın. 10 saniyeden uzun görüntü akışlarının elde edilmesi için bir Z-sürüklenme düzelticisi ekleyin.
13 x 100 milimetrelik bir cam kültür tüpünde, moleküler sınıf agar'ı M9 ve mikrodalgada birkaç saniye boyunca çözerek üç mililitre% 10 agar hazırlayın. Agar pedlerini yapmak için, önce iki kat laboratuvar bandı ekleyerek iki slayt hazırlayın. Ardından iki slaytın arasına bir mikroskop slaydı yerleştirin.
1000 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve kapak slipinin ortasına küçük bir damla agar damlası pipetlemek için kullanın. Agarın üstüne başka bir slayt bastırarak agar'ı düzleştirin. Soğuduktan sonra, 10 mililitrelik bir tüpün açıklığını kullanarak agar'ı küçük bir diske kesin ve ardından çevreleyen agar'ı çıkarın.
Daha sonra, 30 milimolar bir stok oluşturmak için mussimol tozunu M9'da çözerek solucan haddeleme çözeltisini hazırlayın. Haddeleme çözeltisini yapmak için stoğu polistiren boncuklarla bire bir oranında seyreltin. Solucanı görüntüleme için konumlandırmak için, önce 1.6 mikrolitre haddeleme çözeltisini agar pedinin ortasına yerleştirin.
Daha sonra tercih edilen bir solucan toplama kullanarak, istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın. Mussimolün solucan hareketini azaltması için yaklaşık beş dakika bekleyin ve ardından agar pedinin üzerine 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayması bırakın. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, kapak kaymasını hafifçe kaydırarak solucanı yuvarlayın.
Solucanı mikroskopa monte etmek için, kapak kaymasına bir damla daldırma yağı yerleştirin. Parlak alanda düşük büyütme hedefi kullanarak solucanı bulun. Ardından 100x hedefine geçin ve 488 nanometre görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mito GCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.
İn vivo GCaMP görüntüleme için, fesleğen GCaMP floresansı kameranın dinamik aralığının orta aralığında olana kadar görüntüleme lazerini alım ayarlarında ayarlayın ve pozlama süresini 20 milisaniyeye ayarlayın. AVA nöriti GCaMP floresan kullanılarak 100 kat büyütmede konumlandırıldıktan sonra, Z-sürüklenme düzelticisini ayarlayın ve sürekli otomatik netlemeyi başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.
100 kat büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu protokol kullanılarak, sitoplazmik kalsiyum yüksek temporal ve mekansal çözünürlükte ölçüldü. GCaMP6F'nin glutamaterjik AVA komutu internöronlarındaki hücreye özgü ekspresyonu, kalsiyum akışının yönlü bir yayılımını ortaya çıkardı.
GCaMP6F floresansının hücre altı nicelleştirilmesi, sadece 10 mikrometre uzaklıkta bulunan nöritin bir kısmında kalsiyum akışının başlangıcının geciktiğini göstermiştir. Ayrıca, AVA nöriti boyunca bulunan dendritik omurga benzeri yapılar, nörit aktivasyonundan bağımsız olarak meydana gelen ve kalsiyum akışının yayılmasına yol açmayan GCaMP6F floresansında parlamalar gösterdi. Ayrıca, nispi kalsiyum seviyeleri, mitokondriyal matris lokalize kalsiyum göstergesi mito GCaMP'nin AVA'ya özgü bir ifadesine sahip bir solucan suşu kullanılarak tek nöritlerdeki bireysel mitokondride ölçülmüştür.
Sonuçlar, nispeten büyük miktarda kalsiyumun mitokondrinin bir alt kümesine senkron alımını gösterdi. Spesifik olarak, bazı mitokondrilere kalsiyum alımı senkronize edilirken, komşu mitokondrinin kalsiyum aldığı görülmedi. Benzer şekilde, mitokondri alt kümeleri, az miktarda kalsiyumun hızlı alımını ve salınımını göstermiştir.
Bu aynı zamanda eşzamanlı görünüyordu, ancak sadece mitokondrinin bir alt kümesi için. Hız ve ince manipülasyonlar, hayvanları konumlandırmak ve nöronal fonksiyonu korumak için gereklidir. Hayvan sağlığı da her şeyden önemlidir.
Biraz açlık bile sorunludur. Öğrenmesi en zor kısım, hayvanların konfokal mikroskopi için zarar görmeden hızlı bir şekilde yönlendirilmesidir. Benim tavsiyem çok fazla pratik ve iyi kontroller.
Bu protokol, kalsiyumun nöronlardaki diğer hücre altı konumlarından, diğer nöronlardan veya C.elegans'taki nöronlar dışındaki hücrelerden salındığı deneylere uygulanabilir. C.elegans'taki bu yaklaşım hayvanları sağlam bıraktığından, tam bir sinir sisteminin tek nöronlarında in vivo olarak hücre altı kalsiyum kullanımının düzenlenmesi ile ilgili soruları ele almak mümkündür.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, Caenorhabditis elegans'ta in vivo yüksek çözünürlüklü, alt bölme kalsiyum görüntülemesinde ölçülmesiz bir yaklaşım sunar. Yöntem, kalsiyum taşımasını nöronlarda ve fizyolojik koşullar altında nöronal fonksiyonların düzenlenmesini araştırmak için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nöron Görüntüleme
- Kalsiyum Sinyalleme
Arka Plan
- Kalsiyum sinyalleme, nöronal fonksiyonda kritik bir rol oynar.
- C.elegans, in vivo görüntüleme için güçlü bir model olarak hizmet eder.
- Bölmeli kalsiyum dinamiklerinin anlaşılması, sinir mekanizmaları hakkındaki bilgiyi geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Nöronlarda yüksek çözünürlüklü kalsiyum görüntüleme için bir teknik geliştirmek ve göstermek.
- Farklı bağlamlardaki nöronal fonksiyonda kalsiyum düzenlenmesini araştırmak.
- Yaşlanma ve nörodejenerasyon gibi koşullar altında kalsiyum taşımasına dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, görüntüleme için transgenik C.elegans suşlarını kullandı.
- Kalsiyum göstergeleri, genç yetişkin solucanların gonadlarına mikroenjeksiyon ile ifade edildi.
- Görüntüleme, özel mikroskop teknikleri kullanılarak fizyolojik koşullar altında yapıldı.
- Kritik adımlar arasında görüntüleme sırasında sıcaklığın korunması ve solucan hareketinin azaltılması yer aldı.
Ana Sonuçlar
- Kalsiyum akışı, nörit bölgeleri arasında yönlü yayılma ve değişen zamanlama gösterdi.
- Hücrealtı ölçümü, mitokondrilerde senkronize kalsiyum alımını ortaya koydu.
- Önemli bulgular arasında, bireysel nöronlar ve mitokondri düzeyinde kalsiyum dinamiklerini ayırt etme yeteneği yer alır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nöronal mekanizmalara dair daha derin içgörüler sağlayarak yüksek çözünürlüklü kalsiyum görüntülemesini mümkün kılar.
- Nöronal sağlık ve hastalıkla ilgili çeşitli deneysel bağlamlara uygulanabilecek in vivo kalsiyum sinyalleme dinamiğini anlamak için olan çıkarımlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Subcellular calcium imaging in intact neuronal circuits enables mechanistic de-risking of neuronal signaling hypotheses at unprecedented spatial and temporal resolution. This capability supports predictive confidence in early discovery by clarifying how compartmentalized calcium dynamics regulate neuronal function and plasticity. The approach is directly relevant for target validation and translational continuity in neurodegeneration and neuronal injury pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of calcium-dependent signaling mechanisms in live neurons within native circuitry.
- Supports functional target validation by resolving compartment-specific calcium handling in single neurons.
- Facilitates mechanistic de-risking for hypotheses involving neuronal plasticity and degeneration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening targeting calcium signaling pathways.
- Delivers quantitative, reproducible subcellular calcium measurements for assay standardization.
- Enables high-throughput adaptation by leveraging genetically encoded indicators in C. elegans models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular calcium readouts with disease-relevant models of aging, injury, and neurodegeneration.
- Supports longitudinal studies of neuronal function and plasticity in vivo.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neuronal targets.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research in neuroscience-focused pipelines.
- Discovery Biology: Resolves compartmentalized calcium signaling to clarify neuronal pathway mechanisms.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible calcium dynamics data for compound evaluation.
- Analytics: Enables high-resolution measurement of spatial and temporal calcium changes in defined neuronal compartments.
- Translational Research: Connects subcellular calcium handling to disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse neuronal and subcellular calcium studies in C. elegans.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Standardizes subcellular imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuro-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuronal targets and mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands instrumentation capable of rapid, high-resolution imaging and environmental control.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible subcellular measurements.
- Adaptable to other neuronal or non-neuronal cell types in C. elegans with appropriate genetic tools.
- Animal health and precise handling are critical for maintaining physiological relevance and data quality.
