İskemik İnmenin Sıçan Modelinde İmmünofloresan ile Hücre Ölümü Sinyalinin Değerlendirilmesi

Sıçan in vivo modelleri, iskemik inme için patolojik mekanizmaları ve terapötik hedefleri araştırmak için vazgeçilmez araçlardır. Bu çalışma, sıçanlarda orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) takiben enfarktüslü beyin dilimlerinde immünofloresan boyama gerçekleştirmeyi açıklayacaktır.

İskemik inme, dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir. Çalışmalarımız inme için ilaç hedeflerine odaklanmıştır. RUNX1 ve katepsinler gibi ortaya çıkan birkaç hedefle ilgileniyoruz. Bu hedefleri değerlendirmek için, orta serebral arteri tıkayarak iskemik inme için bir sıçan modeli geliştirdik.

Sıçanlarda iskemik inmeyi, orta serebral arteri tıkamak için bir filament yerleştirerek modelliyoruz. Orta serebral arter oklüzyon modeli, TTC, immünofloresan ve TUNEL boyama gibi diğer tekniklerle birlikte klinik öncesi inme çalışmaları için en yaygın kullanılan kemirgen modelidir. İnme patofizyolojisini entegre bir yaklaşımla inceleyebiliriz. İmmünofloresan için, antikorların özgüllüğü, floresan arka planını en aza indirmek ve floresan etiketlerin ve spesifik antikorların özelliklerinden yararlanarak sinyal-gürültü oranını optimize etmek gibi bazı teknik zorluklar vardır. İmmünofloresan, hücresel mimarinin karmaşık manzarasını ve orta serebral arter tıkanıklığı modeli ile moleküler etkileşimleri anlamamızı sağlar.

Bir dizi beyin dokusu, inme için uygun bir zaman penceresi ile potansiyel olarak kurtarılabilir. Sonuçlarımız, orta serebral arter tıkanıklığı sonrası sıçan beyinlerinin sayısında katepsin B ekspresyonunun aktive olduğunu göstermektedir. Artmış apoptoz eşlik eder. Hücre ölümü sinyalinin altında yatan mekanizma üzerine daha ileri çalışmalar, ilaç için yeni hedefler sağlayabilir.

Gelecekteki çalışmamızda, enflamatuar yollarda ve hücre ölümü sinyallerinde potansiyel moleküler hedefleri keşfetmeye devam edeceğiz. Deneysel çalışmalarla keşfedilen bu hedeflerden bazılarının klinik tedaviye çevrilebileceğini ve böylece inme hastaları için sağkalımı ve yaşam kalitesini iyileştirebileceğini umuyoruz.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, anestezi uygulanmış sıçanı sırtüstü pozisyona getirin ve düzenlenmiş bir ısı matı ve bir rektal sıcaklık izleme probu kullanarak vücut sıcaklığını 36.5 ° C'de tutun. Boyundaki cildi tıraş edin ve iyodofor dezenfekte edici bir solüsyon kullanarak dezenfekte edin. Daha sonra, boyunda 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın ve karotis damarlarını ortaya çıkarmak için yumuşak dokuları geri çekin. Forseps kullanarak, sağ ortak karotis arteri veya CCA, dış karotis arter, ECA ve iç karotis arter, ICA'yı izole edin. Dikişler kullanarak proksimal sağ CCA'yı bağlayın. Ardından doğru ICA ve ECA'yı bir mikroklips ile kökenlerinde sıkıştırın. Küçük bir kesiden CCA'nın lümenine yuvarlak bir silikon uçla kaplanmış bir naylon monofilament yerleştirin ve monofilamentin kanamasını ve yerinden çıkmasını önlemek için CCA'ya bir düğüm atın. Sağ ICA mikroklibini açın ve monofilamenti, silikon uç MCA'nın kökenini tıkayana kadar ICA güdüğü boyunca sağ orta serebral artere veya MCA'ya yerleştirin. Naylon monofilamentin açıkta kalan kısmını kesin ve orta hat boyun kesisini kapatın. İki saatlik MCA oklüzyonundan sonra, boyun kesisini açın ve CCA'daki düğümü çözün. Ardından, MCA'yı yeniden perfüze etmek için naylon monofilamenti geri çekin. Ameliyattan sonra, sıcaklık ayarlı bir ısıtma matı ile tutulan ısıtılmış bir kafeste anesteziden iyileşme sırasında fareyi gözlemleyin. Zaya Long Davranışsal Derecelendirme Ölçeğini kullanarak, orta serebral arter tıkanıklığından veya MCAO'dan iki saat sonra ve reperfüzyondan 22 saat sonra nörolojik fonksiyonu değerlendirin. Tüm beyni MCAO model sıçandan izole ettikten sonra, beyni -20 ° C'de 20 dakika boyunca dondurun. Donmuş beyni, dilimler arasında 2 mm mesafe olacak şekilde altı koronal dilim halinde kesin. Dilimleri karanlıkta 37 °C'de 15 dakika boyunca %2 TTC ile boyayın. Daha sonra beyin dilimlerini oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Yakın çekim nesneleri için otomatik moda ayarlanmış bir dijital fotoğraf makinesi kullanarak lekeli dilimlerin fotoğrafını çekin. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve enfarktüs boyutunu ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın. Enfarktüs boyutunu, altı dilimin tümündeki enfarktüs alanının toplamının aynı dilimlerdeki toplam beyin alanının toplamına oranı olarak hesaplayın. MCAO grubunda, sahte grupta enfarktüs olmamasına kıyasla önemli enfarktüs alanları gözlendi. İmmünofloresan analizi için, MCAO model sıçandan alınan sağlam beyni 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Daha sonra beyni% 10,% 15 ve% 30 konsantrasyonlarda,% 10,% 15 ve% 30 konsantrasyonlarda bir dizi sükroz çözeltisi gradyanında kurutun ve doku batana kadar devam edin. Susuz kalmış beyni optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün ve hava kabarcıklarını giderin. Beyni sıvı nitrojen içinde dondurun. Bir kriyostatta, beyni 5 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Donmuş beyin bölümlerini oda sıcaklığında dengeledikten sonra, her biri 5 dakika boyunca steril PBS ile üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında mL başına 20 μg proteinaz K ve% 0.3 Triton X-100 ile inkübe etmeden önce dokuyu bir immünohistokimya kalemi ile ana hatlarıyla belirtin. Bölümleri PBS ile yıkadıktan sonra, belirtilen dokuya% 3 BSA uygulayın ve bloke etmek için oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bloke edici solüsyonu uygun primer antikorla değiştirin ve bölümleri gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Tween-20 içeren steril PBS ile üç kez yıkayın. Gerekli florofora konjuge edilmiş uygun ikincil antikoru ekleyin ve bölümleri ışıktan koruyarak nemlendirilmiş bir odada bir saat inkübe edin. Bölümleri Tween-20 içeren PBS ile yıkadıktan sonra, DAPPI içeren bir montaj ortamı ile boyayın ve kapak fişleri ile örtün. Bir floresan mikroskobunda, lekeli beyin kesitini yakalamak için uyarma dalga boyunu 488 nm'ye, emisyon dalga boyunu 520 nm'ye ve maruz kalma süresini 500 ms'ye ayarlayın.Yaş. Katepsin B immünoreaktivitesi, MCAO grubunun iskemik çekirdeğinde sahte gruba kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Katepsin B immünoreaktivitesi, MCAO grubunun penumbra korteksinde sahte gruba kıyasla önemli ölçüde artmıştır. İskemik çekirdek ve penumbral korteks arasında katepsin B immünoreaktivitesinde anlamlı bir fark gözlenmedi. Başlamak için, MCAO model sıçanından paraformaldehit ile sabitlenmiş beyin dilimlerini, her biri 35 ila 50 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonunda kurutun. Daha sonra beyin dilimlerini 35 ila 50 dakika boyunca terebentin yağı tipi şeffaf biyolojik ajan 1 ile tedavi edin, ardından doku tamamen şeffaf olana kadar 35 ila 50 dakika boyunca ajan 2'yi temizleyin. Şimdi beyin dilimlerini her biri 60 dakika sırayla 1, 2, 3 ve 4 numaralı gömme ortamlarına daldırın. Beyin dilimlerini bir gömme kasetine yerleştirin, sıkıca kapatın ve katılaşma için soğuk hava deposunda saklayın. Mikrotomu kullanarak doku bloğunu 10 μm'de kesin ve ardından 5 μm'de dilimleyin. Doku bölümlerinin 45 ° C'de 30 saniye boyunca bir su banyosunda yüzmesine izin verin ve ardından bunları slaytlara aktarın. Kuruduktan sonra, beyin bölümlerini her biri 10 dakikalık iki döngü boyunca bir temizleme maddesinde deparafinize edin. Daha sonra azalan etanol konsantrasyonlarında beyin bölümlerini yeniden sulandırın. Şimdi bölümü PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın. Fazla nemi aldıktan sonra, her bölüme 100 μL proteinaz K ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. PBS yıkamalarından sonra, her numuneye 100 μL terminal deoksinükleotidil transferaz dengeleme tamponu uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 10 ila 30 dakika inkübe edin. Emici kağıt kullanarak tamponu çıkarın ve TUNEL tahlil kitinden 50 μL etiketleme çalışma solüsyonu ekleyin. Ardından, DAPPI çalışma solüsyonunu bölümlere uygulayın ve çekirdekleri lekelemek için karanlıkta beş dakika inkübe edin. Numuneleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca dört kez durulayın. Fazla sıvıyı çıkarın ve sürgüyü solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamıyla kapatın. Vectra Polaris multispektral görüntüleme sistemini kullanarak lekeli slaytı tarayın. TUNEL boyama, MCAO grubunun penumbral korteksinde sahte gruba kıyasla daha fazla TUNEL pozitif hücre ile apoptozda önemli bir artış gösterdi.