İndüklenen Yapısal Değişikliklerin Değerlendirilmesi için Patates Köklerinin Bitki Paraziti Nematodlarla İn vivo ve İn vitro Enfeksiyonu

Protokol, Solanum tuberosum köklerinin in vivo sera koşullarında bitki parazitik nematodları ve optik mikroskopi ile kök yapısının histokimyasal analizi için patates in vitro transgenik kökleri ile enfeksiyonunu açıklar.

Ekinlerdeki parazitik nematod enfeksiyonları üzerine yapılan araştırmalar, deneysel sonuçları ve verilerin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde etkileyebilecek çevresel koşulların değişkenliğinden etkilenir.

Daha az yer kaplayan, elde etmek için daha az zaman gerektiren ve kontaminasyondan veya konakçı genetik değişkenliğinden arınmış güvenilir bir alternatif olarak bitki paraziti nematodlu patates transgenik köklerinin in vitro kültürlerini geliştirdik.

Mahsul köklerinde nematod enfeksiyonunun zamansal ilerlemesini izlemek zor olmaya devam etmektedir. Diferansiyel boyama teknikleri, enfeksiyon bölgelerini tanımlamak ve nematod yaşam evrelerini hassas bir şekilde ayırt etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.

Sera denemeleriyle karşılaştırıldığında, patates ağır kökleri, mevsimsel veya iklim değişikliklerinden bağımsız olarak nematod gelişiminin tüm aşamalarını sağlamak için sürekli ve kontrol bir sistemi destekler.

Bu nedenle, açıklanan protokol gelecek vaat eden birkaç uygulama sunmaktadır. Örneğin, bitki paraziti nematodların konakçıları nasıl enfekte ettiğine ve manipüle ettiğine dair içgörüler sağlamanın moleküler ve hücresel mekanizmalarına ilişkin ayrıntılı çalışmalara olanak tanır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, bir havucu akan musluk suyu altında yıkayın ve ardından kalıntıları temizlemek için ortak bir deterjan solüsyonuyla yıkayın. Kağıt havluyla kurulandıktan sonra, havucun üst kısmına yaklaşık bir ila iki santimetre içeriye doğru sterilize edilmiş bir metal şiş yerleştirin. Nozullu bir yıkama şişesi ile havucu% 96 etanol ile ıslatın. Havucun alt ucunu sterilize edilmiş bir filtre kağıdına kurulayın. Sonra dikkatlice bir alevden geçirin. Steril bir soyucu ile havucu yukarıdan aşağıya doğru soyun ve alevlendirmeyi tekrarlayın. Üst ve alt kısımları attıktan sonra orta kısmı steril bir Petri kabına koyun. Steril bir bıçak ve cımbız kullanarak bir santimetre kalınlığında bölümler kesin. Bölümleri steril Petri kaplarına aktarın. Plakayı kapattıktan sonra, havuç disklerini sterilize etmek için her iki tarafta 60 dakika UV ışığı altında tutun. Havuç disklerini karanlıkta 25 santigrat derecede bir ila iki hafta kuluçkaya yatırın. Daha sonra, steril bir bıçakla, havuç diskinin merkezinde X şeklinde bir kesi yapın ve sadece yarıya kadar derinliği kesin. İnsizyon içine en az 50 karışık yaşam evresi içeren 50 mikrolitre kök lezyonu nematod süspansiyonu pipetleyin. Petri kabını kapattıktan sonra, karanlıkta 25 santigrat derecede üç aya kadar inkübe edin. Kök lezyonu nematodlarını çıkarmak için, görünür nekrozlu havuç disklerini steril bir cam kaseye yerleştirilmiş sekiz santimetre çapında 75 mikrometre gözenekli bir eleğe aktarın. Daha sonra, diskler kaplanana kadar elek üzerine antibiyotik solüsyonu dökün. Karanlıkta gece boyunca inkübasyondan sonra, nematodları kasenin dibinden sterilize edilmiş bir cam boyama bloğuna aktarmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Boyama bloğuna bir mililitre antibiyotik solüsyonu pipetleyin ve nematodların 30 ila 40 dakika dinlenmesine izin verin. Kullanılmış antibiyotik solüsyonunu pipetleyin ve yıkama işlemini dört ila beş kez tekrarlayın. Kök lezyonu nematod süspansiyonunu hemen kullanın veya 11 santigrat derecede saklayın. Aynı boyuttaki patates yumrularını seçin ve delikli, çürüklü veya yumuşak bölümleri olanları atın. Beş litrelik saksıları bire bir otoklav toprağı ve kum karışımı ile doldurun ve 22,5 gram yavaş salınan NPK gübresi ile karıştırın. Daha sonra patatesleri toprak yüzeyinin dokuz santimetre altına ekin. Saksıları %50 ila 70 nem altında bir seraya yerleştirin. Toprak nemini maksimum su tutma kapasitesinin %70'inde tutmak için sık sık sulayın ve aşırı sıcaklıklardan kaçının. Patates bitkileri ortaya çıktıktan sonra, derinliği görmek için her bitkinin etrafına eşit olarak dağıtılmış dört ila altı delik oluşturun. 30.000 canlı karışık yaşam evresi kök lezyonu nematodu içeren sekiz mililitre süspansiyonu deliklere pipetleyin. Ardından delikleri toprak karışımı ile örtün. Kök lezyonu nematodları içeren kontrol kapları ve saksıları için, aşılama gününde sulamayı durdurun. İki aylık kültürden sonra, patates bitkilerini sökün ve tartmak için sürgünleri ve kökleri ayırın. Kök sistemini dikkatlice yıkayın. Uygun boyama tekniklerini kullanarak RLN atak bölgeleri için kökleri inceleyin. Yıkanmış ve sterilize edilmiş patates yumrularını bir kaba koyun. Yumruları% 25'lik bir ticari ağartma solüsyonu ile örtün. Kabı kapatın ve 15 dakika karıştırın. Çamaşır suyu atıldıktan sonra, yumruları sterilize edilmiş musluk suyuyla üç kez durulayın. Daha sonra, bir akış davlumbazında, yumruları kuvvetli çalkalama ile 15 dakika boyunca% 80 etanol çözeltisine batırın. Etanolü pipetledikten sonra, sterilize edilmiş musluk suyuyla üç kez durulayın. Steril bir neşter ile yumru köklerin periferik kısımlarını çıkarın. İç merkezi parçayı 0,5 santimetre kalınlığında parçalara ayırın. Bölümleri aşılamak için önce bir mililitre Rhizobium rhizogenes süspansiyonunu dokuz mililitre SH ortamı ile karıştırın. Steril bir neşterin ucunu seyreltilmiş süspansiyona batırın ve patates parçalarının yüzeyini beş kez sarın. Segmentler kuruduktan sonra, onları yarı katı SH ortamına yerleştirin ve plazmit transfeksiyonunu kolaylaştırmak için karanlıkta üç gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü günün sonunda, enfekte olmuş segmentleri antibiyotiklerle desteklenmiş yarı katı SH ortamı içeren plakalara aktarın. Üç ay sonra, bir gramlık bir transgenik kök kümesi toplamak için steril cımbız kullanın. Kökleri taze yarı katı antibiyotik içermeyen SH ortamı ile plakanın merkezine aktarın. Nematod yumurta kütlelerini toplamak için kök safralarını elde edin. 20 x büyütmeye ayarlanmış bir dürbün stereo mikroskop altında yumurta kütlelerini dikkatlice çıkarmak için bir çift steril ultra ince uçlu cımbız kullanın. Yumurta kütlelerini beş mililitre steril musluk suyu içeren kapalı bir Petri kabına koyun ve 48 saat boyunca yumurtadan çıkmalarına izin verin. Daha sonra, bir akış başlığında, mililitrede 100 nematod içeren J2 süspansiyonunun beş mililitresini 20 mikrometrelik gözenekli bir elek üzerine pipetleyin. Steril musluk suyu ile yıkadıktan sonra, J2 nematod içeren eleğin alt yarısını% 20'lik bir hidrojen peroksit çözeltisine batırın ve 15 dakika boyunca dairesel hareketlerle karıştırın. Steril musluk suyunu elekten nematodların üzerine dağıtın ve yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Elekleri, son yıkama sırasında nematodların sınırda toplanması için eğin. Ardından, nematodları geri kazanmak için elek kenarından bir mililitre steril ultra saf su pipetleyin. Bir akış davlumbazında, bir gramlık patates transgenik kök yığınını 100 steril nematod içeren SH plakalarına alt kültürleyin. Ko-kültürü 100 x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında düzenli olarak izleyin. Yumurta kütleleri görünür hale geldiğinde, kökleri yeni bir SH orta plakaya alt kültürleyin. Havuç disklerinin kullanımı, üç ay içinde nematod popülasyonlarında ortalama 100 kat artışa neden oldu. Patates bitkileri, düşük kök lezyonu nematod popülasyon sayıları altında gözle görülür bir semptom göstermedi. Asit fuksin ile boyandıktan sonra kök korteksinde Pratylenchus penetrans'ın çeşitli yaşam evreleri gözlendi, bu da dokunun penetrasyonunu ve ilişkili nekrotik lezyonların enfekte bölgelerde açıkça görülebildiğini gösteriyor. Patates transgenik köklerinin gelişimi, patates yumru bölümünde neşter kaynaklı yaralar boyunca ilk hücre kütlesi büyümesini ve ardından transgenik köklerin ortaya çıkmasını gösterdi. Kültür ortamında köklerin sürekli büyümesi gözlendi ve kök kümeleri, sürekli büyüme için başarılı bir şekilde taze kültür ortamına aktarıldı. Patates transgenik kök kültürleri, bitki nematod ko-kültürleri oluşturmak için Meloidogyne chitwoodi ikinci aşama yavruları ile başarılı bir şekilde enfekte edildi. Enfekte kültürlerde yetişkin dişileri ve yumurta kütlelerini içeren kök safraları gözlendi. Meloidogyne chitwoodi tarafından oluşturulan safra dokuları, yumurta kütlelerinin ve yumurtaların oluşumu da dahil olmak üzere tanımlanabilen farklı nematod gelişimi ve üreme aşamaları ile transgenik patates köklerinin enfeksiyonundan sonra görülebildi.