Overview
Fonte: Laboratori di Margaret Workman e Kimberly Frye - Depaul University
L'analisi elementare è un metodo utilizzato per determinare la composizione elementare di un materiale. Nei campioni ambientali come i suoli, gli scienziati sono particolarmente interessati alle quantità di due elementi ecologicamente importanti, l'azoto e il carbonio. L'analisi elementare con la tecnica di combustione flash funziona ossidando il campione con un catalizzatore attraverso la combustione in una camera ad alta temperatura. I prodotti della combustione vengono quindi ridotti a N2 e CO2 e rilevati con un rilevatore di conducibilità termica.
A differenza di altri metodi per la determinazione dell'azoto totale (metodo Kjeldahl) e la determinazione del carbonio totale (metodi Walkley-Black, Heanes o Leco), la tecnica di combustione flash non utilizza sostanze chimiche tossiche ed è quindi molto più sicura da usare.
Questo video dimostrerà l'analisi elementare basata sulla combustione utilizzando lo strumento Flash EA 1112 di Thermo Fisher Scientific.
Principles
I campioni di terreno vengono posti in un disco di stagno e lasciati cadere nel reattore di ossidazione tramite un autocampionatore dove vengono bruciati in un ambiente di ossigeno a più di 900 °C in presenza di un catalizzatore di ossidazione. Il carbonio nel campione viene convertito in anidride carbonica e l'azoto viene convertito in azoto gassoso e alcuni ossidi di azoto.
C + O2 → CO2
4 N + x O2 → N2 + 2 NOx
Il gas elio trasporta questi prodotti in un secondo tubo di reazione riempito di rame che riduce gli ossidi di azoto in azoto gassoso e rimuove l'ossigeno in eccesso. Questo è completato a 680 °C.
NOx + Cu → N2 + CuO
O2 + Cu → CuO
Il flusso di gas scorre quindi attraverso un filtro riempito con perclorato di magnesio per rimuovere qualsiasi vapore acqueo prima che il flusso raggiunga la colonna del gascromatografo.
L'N2 uscirà prima dalla colonna di gascromatografia a circa 110 s, e poi il CO2 uscirà a circa 190 s. Utilizzando una curva standard creata utilizzando acido aspartico, è possibile determinare %N e %C nel campione di terreno.
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Procedure
1. Preparazione di campioni di terreno
- Campioni di terreno asciutto a 60 °C per 48 ore.
- Passare il terreno attraverso un setaccio di 2 mm x 2 mm.
- Mettere circa 5 g di terreno nella smerigliatrice del mulino a sfere e macinare per 2 minuti. È importante ottenere un campione omogeneo poiché la dimensione del campione sarà molto piccola.
- Mettere il terreno macinato in un piccolo contenitore e conservare in un essiccatore fino al momento dell'uso.
2. Impostazione dei parametri dello strumento
- Accendi lo strumento Flash EA 1112 nella parte posteriore ruotando l'interruttore.
- Accendere il computer.
- Fare doppio clic sull'icona "Eager 300" per avviare il programma software che esegue lo strumento.
- Fare doppio clic sull'icona "NC Soils" per aprire il metodo che esegue la configurazione dello strumento per i terreni.
- Riscaldare lo strumento aprendo "Modifica parametri dell'analizzatore elementare" e facendo clic sul pulsante "Invia". I parametri devono essere i seguenti (Vedi Figure 1–3):
a. Temperature: Sinistra = 900 °C, Destra = 680 °C, Forno = 50 °C
b. Portata gas: Portatante = 130 mL/min, Ossigeno = 250 mL/min, Riferimento = 100 mL/min
c. Durata ciclo = 360 s
d. Ritardo di campionamento = 12 s
e. Fine iniezione di ossigeno = 5 s
f. Rivelatore = Filamento acceso - Creare una tabella di esempio facendo clic su "Modifica tabella di esempio" e quindi su "Riempi tabella di esempio". Modificare il nome del file alla data odierna. Immettere il numero di campioni che si prevede di eseguire, inclusi gli standard e gli spazi vuoti. Quindi fare clic su "Sostituisci" per sostituire l'ultima tabella di esempio creata con la nuova tabella di esempio.
3. Creazione di una curva standard
- Usando la pinna, rimuovere un disco di latta dalla confezione e modellarlo a forma di tazza utilizzando lo speciale dispositivo di tenuta. Evitare di toccare il disco di latta con le dita per evitare di trasferire oli dalla punta delle dita. (Vedi figure 4–5)
- Usando la pinza, posizionare il disco di stagno sulla microbilanza e azzerare la bilancia.
- Usando una pinza, rimuovere il disco di stagno dalla microbilanza e usando una microspatula, posizionare circa 1 mg di acido aspartico standard nel disco di stagno.
- Pesare il disco di stagno con lo standard di acido aspartico sulla microbilatta. Immettere questo peso nella tabella dati del software Eager 300 sul computer.
- Sigillare il disco di stagno con la pinica in modo che nessuno degli standard di acido aspartico fuoriescerà da esso. Inserire la confezione di latta nell'autocampionatore. (Vedi Figura 6)
- Ripetere i passaggi 3.1 – 3.5, utilizzando circa 5 mg di acido aspartico standard.
- Ripetere i passaggi 3.1 – 3.5, utilizzando circa 7,5 mg di acido aspartico standard.
- Ripetere i passaggi 3.1 – 3.5, utilizzando circa 10 mg di acido aspartico standard.
4. Caricamento dell'autocampionatore con campioni di terreno
- Usando la pinna, rimuovere un disco di latta dalla confezione e modellarlo a forma di tazza usando il dispositivo di tenuta. Non dovresti toccare la latta con le dita per evitare di trasferire oli dalla punta delle dita.
- Usando la pinza, posizionare il disco di stagno sulla microbilanza e azzerare la bilancia.
- Rimuovere il disco di stagno dalla microbilanza e posizionare circa 50 mg di terreno omogeneizzato nel disco di stagno usando una microspatula.
- Pesare il disco di stagno con il campione di terreno sulla microbilatta. Immettere questo peso nella tabella dati del software Eager 300 sul computer.
- Sigillare il disco di stagno usando la pinca in modo che il terreno sia contenuto. Trasferire la confezione di latta nel vassoio dell'autocampionatore.
- Ripetere i passaggi 4.1 – 4.5 per tutti i campioni. Si raccomanda di eseguire prove triplicate di ciascun campione. Un esperimento triplicato è considerato una buona regola empirica per escludere errori sperimentali.
5. Esecuzione degli esempi
- Quando sono state raggiunte le temperature appropriate sullo strumento, la spia verde "Temperature Ready" si accende. Nella parte inferiore dello schermo del computer, dirà anche "Pronto per l'analisi".
- Prima di iniziare l'esecuzione del campione, fare clic su "File" e "Metodo di salvataggio" per salvare i dati appena inseriti. Si consiglia di salvare il metodo con il cognome e la data.
- Per iniziare la corsa, fai clic sulla freccia verde e premi "Inizia ora".
- Ci vorranno circa 6 minuti per campione per funzionare.
- Al termine dell'esecuzione, è possibile visualizzare i risultati facendo clic su "Ricalcolo", quindi su "Riepiloga risultati".
Figura 1. Flash EA 1112 parametri impostazione schermata 1.
Figura 2. Flash EA 1112 parametri impostazione schermata 2.
Figura 3. Flash EA 1112 parametri impostazione schermata 3.
Figura 4. Rimozione di un disco di latta con pinp.
Figura 5. Il disco di latta stampato a forma di tazza utilizzando il dispositivo di tenuta.
Figura 6. Il pacchetto di latta viene inserito nell'autocampionatore.
L'analisi delle quantità di carbonio e azoto nei campioni ambientali - un processo noto come "analisi elementare" - fornisce importanti informazioni sulle proprietà ecologiche dell'ambiente.
Carbonio e azoto sono due degli elementi più importanti per la vita. Il carbonio è il fondamento dei composti organici che costituiscono la base di tutti gli esseri viventi ed è particolarmente utile come misura per molecole come i carboidrati, la fonte di energia primaria per gli organismi. D'altra parte, l'azoto si trova in molecole come nucleici e amminoacidi. Questi servono, rispettivamente, come materiale genetico e come elementi costitutivi delle proteine utilizzate dagli organismi per la struttura e la funzione.
Poiché queste diverse classi di molecole organiche hanno ruoli biologici diversi, gli organismi li richiedono in quantità diverse. Ad esempio, i microrganismi nel suolo in genere richiedono fonti di cibo con un rapporto C: N di 24: 1. Poiché diversi residui vegetali hanno diversi rapporti C: N che vanno da 13: 1, come l'erba medica, a 57: 1, come nel mais, saranno decomposi da microbi a velocità diverse e in diverse misura, influenzando a loro volta il modo in cui i nutrienti vengono restituiti al suolo.
Questo video introdurrà i principi di analisi della composizione elementare del carbonio e dell'azoto; un protocollo per l'esecuzione di analisi elementari su campioni di suolo; e infine, alcune applicazioni di questo metodo di analisi alla ricerca ambientale.
L'analisi elementare può essere eseguita in diversi modi, come l'uso di reazioni chimiche specifiche, che spesso coinvolgono acidi forti, con conseguente prodotti caratteristici che possono essere rilevati. Un importante miglioramento nella metodologia di analisi elementare è stato lo sviluppo della tecnica di combustione flash, che ha rimosso la necessità di utilizzare sostanze chimiche pericolose, ha notevolmente semplificato e accelerato il processo e ha permesso l'automazione.
La base dell'analisi elementare basata sulla combustione flash è quella di ossidare il campione in una "camera di ossidazione", bruciandolo in presenza di ossigeno ad alte temperature di circa 1.000 °C in presenza di un catalizzatore, che accelera la reazione. Questo converte il carbonio nel campione in gas di anidride carbonica e l'azoto in ossido di azoto e gas di azoto. Un "gas vettore" inerte come l'elio viene quindi utilizzato per trasportare questi prodotti di combustione in una "camera di riduzione" con riempimento di rame, dove gli ossidi di azoto vengono ulteriormente convertiti in azoto gassoso. Il vapore acqueo in eccesso viene rimosso dalla miscela di gas mediante filtrazione con un essiccante come il perclorato di magnesio.
I prodotti di combustione flash possono quindi essere separati mediante gascromatografia, durante la quale le molecole di gas passano attraverso tubi, chiamati colonna, contenenti un sottile rivestimento di liquido o polimero. I gas si dissolvono e vaporizzano ripetutamente da questo substrato mentre passano attraverso la colonna, a velocità che dipendono da quanto fortemente le molecole interagiscono con il substrato e il gas vettore. Una specie che trascorre più tempo disciolta nel substrato viaggerà più lentamente attraverso la colonna, consentendo così di differenziare i gas.
Una volta usciti dalla colonna, i gas possono essere identificati, ad esempio, rilevando quanto bene conducono il calore, una proprietà nota come conduttività termica. Tracciando il tempo necessario a ciascun gas per viaggiare attraverso la bobina, gli scienziati ottengono un "cromatogramma" con picchi che rappresentano ciascun gas. Calcolando le quantità rilevate di anidride carbonica e gas azoto utilizzando l'area sotto i rispettivi picchi, è possibile dedurre il rapporto C: N nel campione originale.
Ora che hai compreso i principi dell'analisi elementare del carbonio e dell'azoto utilizzando il metodo di combustione flash, esaminiamo un protocollo per eseguire questo utilizzando un analizzatore elementare automatizzato.
Per preparare i campioni di terreno per l'analisi, in primo luogo, asciugare i campioni in un forno a 60 °C per 48 ore. Quindi, passare il terreno essiccato attraverso un setaccio di 2 x 2 mm e scartare qualsiasi particella di terreno che non passa attraverso. Quindi, utilizzare una smerigliatrice a sfere per macinare circa 5 g di terreno per 2 minuti per creare una polvere omogenea. Mettere il terreno macinato in un piccolo contenitore come una fiala di polietilene e conservarlo in un essiccatore fino al momento dell'uso.
Impostare i parametri di analisi sull'analizzatore elementare in base alle istruzioni del produttore. Questi includono le temperature del forno di ossidazione, del forno di riduzione e del forno per gascromatografia, la portata del gas vettore, la velocità di iniezione di ossigeno, la portata del gas di riferimento, il tempo di funzionamento del ciclo, il ritardo tra la caduta del campione e l'iniezione di ossigeno nella camera di ossidazione e la durata dell'iniezione di ossigeno.
Al fine di determinare quantitativamente la composizione del campione, viene prima creata una curva standard utilizzando diverse quantità di un composto di composizione nota, come l'acido aspartico.
Per fare questo, utilizzare prima una pinna per rimuovere un disco di stagno da una confezione e modellarlo a forma di tazza utilizzando il dispositivo di tenuta specializzato. Evitare di toccare il disco di latta con le dita, in quanto ciò potrebbe portare al trasferimento di oli sul disco.
Ora, posiziona la tazza di latta su una microbilancia e imposta la tara. Rimuovere la tazza di latta, quindi utilizzare una microspatula per posizionare circa 1 mg dello standard di acido aspartico nella tazza. Pesare la tazza e registrare la massa. Quindi, sigillare la tazza di latta e posizionarla nell'autocampionatore, che consegnerà automaticamente ogni campione nella camera di reazione.
Ripetere i passaggi precedenti per diverse quantità dello standard. Quindi, inserire tutti gli standard nell'autocampionatore.
Erogare e pesare i campioni di terreno in tazze di stagno in modo simile agli standard, utilizzando circa 50 mg di ciascun campione di terreno omogeneizzato. Preparare ogni campione in triplice copia.
Una volta che tutti i campioni sono stati inseriti nell'autocampionatore e sono state raggiunte le temperature appropriate nello strumento, impostare le misurazioni per l'esecuzione. Il software dello strumento produrrà un cromatogramma per ogni standard e campione.
A seconda dei parametri utilizzati, il picco per l'azoto gassoso dovrebbe essere a circa 110 s sul cromatogramma, mentre il picco di anidride carbonica viene rilevato a circa 190 s. Le curve standard sono generate con acido aspartico, che ha un rapporto carbonio/azoto di 4 a 1. Con questa conoscenza, insieme alla concentrazione di ogni standard, l'area sotto ogni picco può essere utilizzata per calcolare la quantità di azoto e carbonio in ciascun campione.
Sulla base della massa del campione originale, è possibile calcolare la percentuale di azoto e la percentuale di carbonio di ciascun campione. In questa dimostrazione, il rapporto C: N di questo campione di terreno è risultato essere di circa 13: 1, inferiore al rapporto di 14,25: 1 che di solito si trova per il suolo sotto boschi aperti e indicativo di boschi dominati dagli invasivi alberi di olivello spinoso europei.
L'analisi del contenuto di carbonio e azoto può essere applicata a una varietà di campioni ambientali oltre al suolo e ha ampie applicazioni nella ricerca ambientale.
In questo esempio, i ricercatori hanno raccolto campioni d'acqua da vari habitat marini, come le barriere coralline. Per comprendere la disponibilità di nutrienti organici per le comunità microbiche marine, sono stati misurati vari parametri chimici, tra cui l'analisi elementare del carbonio e dell'azoto. I livelli di carbonio organico disciolto sono stati misurati direttamente dal campione d'acqua, mentre il particolato organico è stato filtrato dall'acqua e analizzato.
L'analisi elementare può anche essere utilizzata per monitorare la perdita di nutrienti nel deflusso dall'irrigazione di paesaggi urbani e prati, che possono inquinare le riserve idriche. Qui, gli scienziati hanno creato appezzamenti di prova per simulare i paesaggi urbani e comprendere meglio questo processo. Una varietà di test chimici sono stati utilizzati per analizzare nutrienti specifici come nitrati e ammoniaca nel deflusso raccolto e l'analisi elementare basata sulla combustione è stata utilizzata per misurare i livelli di carbonio organico disciolto e azoto.
Infine, l'analisi del rapporto C:N nelle carcasse di erbivori ha rivelato un interessante legame tra il rischio di predazione e il tasso di decomposizione nel suolo. In questo studio, le cavallette sono state allevate con o senza il rischio di predazione da parte dei ragni. Le carcasse di queste cavallette sono state poi lasciate decomporre in appezzamenti di terreno, e i detriti vegetali sono stati successivamente aggiunti al terreno per la decomposizione.
L'analisi elementare ha mostrato un leggero aumento del rapporto C/ N nelle cavallette allevate con rischio di predazione, ma questo a sua volta ha portato a una significativa diminuzione del tasso di decomposizione nel suolo in cui la cavalletta stressata è stata decomposa, indicando dinamiche complesse inaspettate nel ciclo dei nutrienti dell'ecosistema.
Hai appena visto il video di JoVE sull'analisi del carbonio e dell'azoto dei campioni ambientali. Ora dovresti capire i principi alla base di questo metodo di analisi; come eseguirlo utilizzando un analizzatore elementare di combustione flash; e alcune delle sue applicazioni nelle scienze ambientali. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Results
Per ogni campione viene prodotto un cromatogramma che mostra la quantità di azoto e carbonio nel campione (Figura 7).
Le aree sotto la curva in ciascuno dei picchi nel cromatogramma del campione vengono confrontate con le curve standard (Figure 8 e 9) e viene calcolata la quantità di azoto e carbonio nel campione. In base al peso del campione originale, vengono calcolati %N e %C (Figura 10).
Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Cromatogramma che mostra i picchi di azoto e carbonio.
Figura 8. Curva standard di analisi per l'azoto.
Figura 9. Curva standard di analisi per il carbonio.
Figura 10. Calcolo di %N e %C, in base al peso del campione originale.
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Applications and Summary
Il rapporto carbonio/azoto (C:N) nel suolo è un rapporto tra la massa di carbonio e la massa di azoto nel campione di suolo. Il rapporto C: N del suolo e di qualsiasi cosa messa sul terreno (come la copertura dei residui delle colture) può influenzare la decomposizione dei residui delle colture e il ciclo dei nutrienti. I microrganismi del suolo hanno un rapporto C:N di circa 8:1. Per mantenere questo rapporto, devono acquisire carbonio e azoto dall'ambiente. Tuttavia, poiché parte del carbonio che i microrganismi acquisiscono deve essere utilizzato come fonte di energia oltre a ciò di cui ha bisogno per il mantenimento del corpo, i microrganismi richiedono un rapporto C: N di circa 24: 1. Se sul terreno viene posizionata una lettiera fogliare o una copertura del suolo con un rapporto C:N superiore a 24:1 (ad esempio,stover di mais con un rapporto C:N di 57:1), i microrganismi dovranno utilizzare l'azoto del terreno per decomporre il materiale della lettiera. Ciò si traduce in un deficit di azoto nel terreno. Se sul terreno viene posta una lettiera fogliare o una copertura del suolo con un rapporto C:N inferiore a 24:1(ad esempio,fieno di erba medica con un rapporto C:N di 13:1), ci sarà dell'azoto rimasto dopo la decomposizione del materiale della lettiera, che verrà rilasciato nel terreno come nutrienti.
L'analisi elementare non solo può essere utilizzata per determinare il rapporto C: N dei campioni di terreno, ma può anche essere utilizzata per determinare il rapporto C: N nei materiali vegetali, come foglie di alberi e residui di colture. Queste informazioni sono importanti per gli agricoltori al fine di aiutarli a decidere quale tipo di copertura per le colture utilizzare. Il rapporto C: N del residuo colturale aggiunto per coprire il terreno influenza la velocità con cui il residuo si decomporrà. Ciò ha implicazioni sul fatto che il suolo sia protetto o meno per il periodo di tempo desiderato.
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