Overview
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס ג'רבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר
ניתוח איכות המים עוקב אחר השפעות אנתרופוגניות כגון מזהמים, חומרים מזינים, פתוגנים, וכל מרכיב אחר שיכול להשפיע על שלמות המים כמשאב. זיהום צואה תורם פתוגנים מיקרוביאליים המאיימים על בריאות הצמח, בעלי החיים והאדם עם מחלות או מחלות. דרישות מים גוברות ותקני איכות מחמירים מחייבים פיקוח על אספקת מים למשאבי אדם או סביבה לרמות פתוגן נמוכות. עם זאת, ניטור כל פתוגן הקשור לזיהום צואה אינו ריאלי, שכן טכניקות מעבדה כרוכות בעבודה, זמן ועלויות נרחבות. לכן, זיהוי עבור אורגניזמים אינדיקטור מספק טכניקה פשוטה, מהירה, וחסכונית לניטור פתוגנים הקשורים לתנאים לא היגייניים.
Principles
אינדיקטורים הם אורגניזמים הניתנים לזיהוי בקלות שנוכחותם מתואמת ישירות לפתוגנים אחד או יותר המזהמים סביבה. על מנת להיחשב אינדיקטור מתאים, אורגניזם חייב לעמוד בחמשת הקריטריון הבא:
- האורגניזם אינדיקטור חייב להיות נוכח כאשר הפתוגן קיים, ואת האורגניזם אינדיקטור חייב להיעדר כאשר הפתוגן נעדר.
- הריכוז של האורגניזם האינדיקטור חייב לתאם עם הריכוז של הפתוגן. עם זאת, האורגניזם אינדיקטור תמיד צריך להימצא במספרים גבוהים יותר.
- האורגניזם אינדיקטור צריך להיות מסוגל לשרוד קל יותר וארוך יותר בסביבה מאשר הפתוגן.
- זיהוי עבור האורגניזם מחוון צריך להיות קל, בטוח, וזול.
- האורגניזם אינדיקטור צריך להיות יעיל עבור כל סוגי המים.
רוב האינדיקטורים הם אורגניזמים אנטריים או וירוסים, אשר נמצאים בדרך כלל במערכות העיכול של יונקים ומערכות העיכול של העופות בדם חם, המעניקים קשר ישיר לזיהום צואה. עם זאת, אינדיקטורים רבים יכולים להיות חוסר יעילות עקב מתאם לקוי עם פתוגנים מסוימים. שניים מהאורגניזמים המקובלים ביותר הם Escherichia coli ו coliforms בשל הצמדות צואת שלהם, וקלות בניתוח מעבדה.
Colilert היא גישה מוגדרת של טכנולוגיית מצע (DST) לזיהוי סימולטני, זיהוי ספציפי ואישור עבור E. coli ו coliforms הכולל בדגימות מים. טכניקת מעבדה זו משתמשת בחומרים מזינים מצע ספציפיים לכל מסלול חילוף החומרים של אורגניזמים אינדיקטור, מונים רק מיקרואורגניזמים הרצויים, אשר משחררים אות כאשר החיידקים משנים את המתחם. בנוכחות קוליפורם, החומרים המזינים האורתו-ניטרופיניל-β-D-גלקטופיראנוסיד (ONPG) עוברים הידרוליזה על ידי האנזים β-גלקטוזידאז של קוליפורם. תרכובת המוצר, אורתו-ניטרופיניל, היא כרומוגן המשחרר אות צבע, והופך את המים לצהובים(איור 1).
איור 1. סכמטי מראה אורתו-ניטרופיניל משחרר אות צבע, הפיכת המים צהובים.
בנוכחות E. coli, מתילומליפריל-β-D-glucuronide (MUG) מנוכר על ידי אנזים glucuronidase של החיידקים, המייצר מוצר מתילומבליפרון כי פלואורסים כחולים-ירוקים תחת אור אולטרה סגול (איור 2).
איור 2. סכמטי המציג את מתילום-בליפריל-β-D-glucuronide (MUG) מנגיש על ידי אנזים glucuronidase של החיידק, לייצר מוצר מתילומברליפרון כי פלואורסים כחול-ירוק תחת אור אולטרה סגול.
קולירט יכול להתבצע כמבחן היעדר נוכחות (P-A) כדי לציין אם האורגניזמים קיימים במדגם או לא. בדיקה זו הושלמה על ידי המסת המצע לדגימות מים 100 מ"ל, דגירה ב 35 ± 0.5 °C (24 °F), וצפייה באותות הצבע. ניתן לכמת את נוכחות האינדיקטורים גם על ידי שימוש במערכת הקובעת את המספר ה סביר ביותר (MPN) עבור כל אורגניזם. הליך זה כרוך בהמסת המצע לדגימות מים של 100 מ"ל החתומות למגש המכיל 49 בארות גדולות ו -48 בארות קטנות. המגש הוא דגירה ב 35 ± 0.5 °C (5 °F) עבור 24 שעות, ולאחר מכן הבארות המכילות שינויי צבע חיוביים נספרים. היחס בין בארות גדולות לקטנות המכילות אותות חיוביים מיושר לתרשים MPN המספק את הכימות לנוכחות של כל אורגניזם אינדיקטור נוכח. תקנות מי השתייה בארצות הברית מחייבות כי אפס קוליפורמים יהיו נוכחים ב-100 מ"ל של מי שתייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. נוכחות קולירט – מבחן היעדרות (P – A)
- פתח את בקבוק קולירט פלסטיק 100 מ"ל. הבקבוק כולל כמות קטנה של אבקת ריאגנט כי הוא הכרחי עבור התגובות הנכונות, לא להשליך את האבקה.
- הוסף דגימת מים 100 מ"ל לבקבוק קולירט.
- פתחו את צינור הכרית המכיל את המצע התזונתי ושפכו את התכולה לדגימת המים בתוך בקבוק קולירט.
- כובע ולאטום את בקבוק קולירט. לנער את הבקבוק במרץ, שוב ושוב הפוך את הבקבוק עד המצע מומס לחלוטין.
- לדגור את תערובת דגימת ריאגנט / מים בתוך הבקבוק ב 35 ± 0.5 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- שימו לב לשינוי הצבע הצהוב בתערובת דגימת ריאגנט/מים. הצבע הצהוב מציין שקולפורם קיים. מים צלולים או ללא שינוי בצבע מציין כי קוליפורמים נעדרים.
- לחשוף את דגימת ריאגנט / מים לאור אולטרה סגול ולהתבונן פלואורסצנטיות כחולה. פלואורסצנטיות כחולה מצביעה על כך שאי-קולי נוכח. אין פלואורסצנטיות המצביעה על כך שאי קולי נעדר (איור 3).
איור 3. בדיקת P-A שלילית (משמאל), קוליפורם חיובי (אמצע) ו- E. coli חיובי (מימין).
2. קולירט MPN: מגש קוואנטי 2000
- פתח את בקבוק קולירט, ודגימת מים 100 מ"ל לתוך בקבוק קולירט.
- פתחו את צינור הכרית המכיל מצע מיז'י ומזגו את התכולה לדגימת המים בתוך בקבוק קולירט.
- כובע ולאטום את בקבוק קולירט. לנער את הבקבוק במרץ, שוב ושוב הפוך את הבקבוק עד המצע מומס לחלוטין.
- פתחו בזהירות את מגש Quanti 2000 על-ידי לחיצה על הקצוות בחלק העליון של המגש והחזרת כרטיסיית הנייר. תמשיך ללחוץ כך שהמגש יהיה פתוח.
- יוצקים את תערובת דגימת ריאגנט/מים לתוך המגש, ולאחר מכן לדגור על המדגם בתוך המגש ב 35 ± 0.5 °C (5 °F) במשך 24 שעות.
- שימו לב לשינוי הצבע הצהוב בתערובת דגימת ריאגנט/מים. ספירת מספר בארות גדולות וקטנות המסמן נוכחות חיובית עבור קוליפורמים. הצבע הצהוב מציין שקולפורם קיים. מים צלולים או ללא שינוי בצבע מציין כי קוליפורמים נעדרים.
- לחשוף דגימת ריאגנט / מים לאור אולטרה סגול ולהתבונן פלואורסצנטיות כחולה. לספור את מספר בארות גדולות וקטנות המסמן נוכחות חיובית עבור E. coli. הפלואורסצנטיות הכחולה מצביעה על כך שאי קולי נוכח. אין פלואורסצנטיות המצביעה על כך שאי קולי נעדר.
- השתמש בגיליון המגש Quanti 2000 MPN (איור 4) כדי לכמת את הריכוז עבור כל אורגניזם אינדיקטור הנמצא ב- 100 מ"ל של מים. השתמש בגיליון האלקטרוני כדי להשוות בין גדול: יחס באר חיובי קטן כדי למנות נוכחות עבור שני האורגניזמים אינדיקטור.
איור 4. קוואנטי-מגש שלילי (משמאל), קוליפורם חיובי (אמצע) ו- E. coli חיובי (מימין).
ניתוח איכות המים חיוני לשמירה על שלמות משאבי המים. נוכחותם של מיקרואורגניזמים אינדיקטור מתואמת עם נוכחות של חומר צואתי, אשר עשוי להכיל פתוגנים גורמי מחלות. לפיכך, ניתן להשתמש באורגניזמים אינדיקטוריים כדי להעריך את הבטיחות של אספקת מים.
זיהום צואה במים מהווה סיכון משמעותי לבריאותם של צמחים, בעלי חיים ובני אדם, כמו פתוגנים במערכת העיכול הם לשפך במספרים גבוהים מאוד בצואה. עם זאת, ניטור דגימות מים עבור כל סוג של פתוגן ייחודי הקשורים זיהום צואה אינו ריאלי. סקר עבור אורגניזמים אינדיקטור מספק דרך פשוטה, מהירה, וחסכונית לזהות זיהום צואה במשאבי מים.
סרטון זה ימחיש את העקרונות העומדים מאחורי שימוש באורגניזמים אינדיקטוריים להערכת איכות המים, כיצד לבדוק דגימות מים שנאספו, ואת הפרשנות וכימות הנתונים המתקבלים.
כדי לשמש כאינדיקטור איכות מים, אורגניזמים חייבים לעמוד בחמישה קריטריונים ספציפיים. ראשית, זה צריך להיות ניתן לזיהוי במים שבו הפתוגן קיים, ונעדר כאשר הפתוגן נעדר. שנית, מספר האורגניזמים מחוון חייב להתאים עם רמות פתוגן. זה גם צריך להיות קשה יותר ולהתמיד זמן רב יותר בסביבה מאשר הפתוגן. לבסוף, הזיהוי צריך להיות קל, בטוח וזול, ויעיל בכל סוגי המים.
שתיים מקבוצות האינדיקטור החיידקיות הנפוצות ביותר הן קוליפורמים כוללים וקולפורמים צואתיים, בדרך כלל E. coli. ניתן למצוא קוליפורמים כוללים במעי היונקים, אך עשויים להתרחש באופן טבעי גם בקרקע ובמים על פני השטח. קוליפורמים צואתיים הם תת-קבוצה התלויה כולה במערכת העיכול של יונקים וציפורים ונמשכות ללא הרף בצואה. קוליפורמים פגיעים לאותם לחצים כמו פתוגנים נפוצים רבים במעיים, כגון טיפול במים או רמות תזונתיות נמוכות, נוכחותם במדגם מים היא אינדיקטור שימושי לנוכחות הפוטנציאלית של פתוגנים. הן קוליפורמים הכוללים ו- E. coli מזוהים בקלות בסביבת המעבדה.
לגילוי, מצעים כימיים מתווספים לדגימה כי קוליפורמים לעכל, וכתוצאה מכך שינוי צבע. עבור coliforms הכולל, ONPG הוסיף מומר ניטרופינול, הפיכת המים צהובים. עבור קוליפורמים צואתיים, E. coli ממיר MUG למוצר מתיל-umbelliferone כי פלואורסים כחול-ירוק תחת אור אולטרה סגול. ביישום הפשוט ביותר שלה, בדיקת המצע יכולה לאשר נוכחות או היעדר קוליפורמים הקיימים במים בזמן הדגימה.
בניגוד לשיטה איכותית זו, ניתן להעריך את מספר הלוליפים הכוללים לכל דגימה באמצעות מגש מחולק למחיצות מיוחד. לאחר שהמצע תגובתי מומס, דגימת המים מתווספת למגש המכיל בארות גדולות וקטנות, ולאחר מכן דגירה. וולס המציג את שינוי הצבע נספר, והיחס בין בארות קטנות לגדולות המדגים אותות צבעוניים חיוביים מיושר לתרשים המציין כמות. אספקת מי השתייה בארה"ב חייבת להכיל אפס קוליפורמים כוללים לכל 100 מ"ל.
כעת, כאשר אנו מכירים את העקרונות של שימוש באורגניזמים אינדיקטור כדי לזהות ולכומת זיהום מים, בואו נסתכל על האופן שבו זה מתבצע במעבדה.
לאחר איסוף דגימות, להביא אותם למעבדה לבדיקה. כדי להתחיל, לפתוח בקבוק פלסטיק 100 מ"ל. בקבוקים עשויים להכיל כמות קטנה של אבקת נתרן thiosulfate ריאגנט המשמש כדי להבטיח את הנטרול של כלור שעשוי להיות נוכח. הוסף 100 מ"ל של דגימת מים לתוך הבקבוק. פתחו צינור כרית המכיל מצע מיז'י ומזגו את התכולה לדגימת המים שבתוך הבקבוק. מכסים ולאטום את הבקבוק, ואז לנער במרץ, שוב ושוב הפוך את הבקבוק עד המצע נמס לחלוטין. לאחר מכן, לדגור על בקבוק דגימה ריאגנט ב 35 °C (5 °F) עבור 24 שעות.
שימו לב לשינוי הצבע הצהוב בתערובת ריאגנט לדוגמה. צבע צהוב מציין כי coliforms קיימים. אין שינוי בצבע המציין כי קוליפורמים נעדרים. לבסוף, לחשוף את תערובת מדגם ריאגנט לאור אולטרה סגול להתבונן. פלואורסצנטיות כחולה, בשילוב עם שינוי צבע צהוב, מציינת כי E. coli קיים. אין פלואורסצנטיות מצביעה על היעדרות.
ניתן גם לקבוע את המספר הניכר ביותר, או MPN, עבור דגימות. פתח בקבוק, ולהוסיף 100 מ"ל של דגימת מים. פתחו את צינור הכרית של המצע התזונתי ויוצקים את התוכן לדגימת המים בבקבוק. תכובעו ותאטמו את הבקבוק. לנער במרץ, היפוך שוב ושוב עד המצע מתמוסס לחלוטין. פתח בזהירות את המגש על-ידי סחיטה של הקצוות בחלק העליון והחזר את כרטיסיית הנייר. יש להפעיל לחץ מתמיד כדי להשאיר את המגש פתוח. יוצקים את תערובת ריאגנט מדגם לתוך המגש ולאטום. לדגור על המגש ב 35 °C (5 °F) במשך 24 שעות.
שימו לב לשינוי הצבע במגש התערובת מדגם ריאגנט. לספור את מספר בארות גדולות ובארות קטנות שהפכו צהובות כדי לציין את נוכחותם של קוליפורמים. לאחר מכן, לחשוף את מגש מדגם ריאגנט לאור אולטרה סגול ולצפות פלואורסצנטיות כחולה. לספור את מספר בארות גדולות וקטנות המסמן נוכחות חיובית של E. coli.
באמצעות גיליון MPN שסופק, לכמת את הריכוז עבור כל אורגניזם אינדיקטור נוכח 100 מ"ל של מים. מצא את מספר בארות חיוביות קטנות לאורך החלק העליון של הטבלה, ואת מספר בארות חיוביות גדולות על ציר הצד השמאלי. הצומת של השניים ייתן דמות המייצגת את המספר סביר ביותר, שהוא המספר המשוער של אורגניזמים לכל 100 מ"ל.
סך בדיקות זיהוי קוליפורם ו- E. coli משמשות לבדיקת זיהום במגוון דגימות מים.
מים המיועדים לצריכה אנושית, או ראויים לשתייה, נבדקים באופן שגרתי לזיהום. על מנת שהמים ייחשבו לבטוחים, הוא אמור להכיל פחות מ-1 קוליפורם לכל 100 מ"ל. כאן, מים מהברז נאספו, ונבדקו לזיהום קוליפורם או E. coli הכולל, כפי שהוכח בעבר. התוצאות קבעו אם מקור מים בטוח לצריכה.
מדגם נוסף שנבדק בדרך כלל הוא שפכים מטופלים. יש לבדוק את המים כדי לוודא שהם בטוחים לשחרור לסביבה או לשימוש חוזר לשימוש אנושי. כפי שצפויות רמות גבוהות של זיהום לפני הטיפול, דגימת הביוב הגולמי מדוללת ל-1:100,000. דגימות אלה היו כפופות לאחר מכן לבדיקות זיהוי קוליפורם ו- E. coli הכוללות, וערכי MPN שחושבו. הערך הבטוח לאחר העיבוד צריך להיות אפס חיידקי אינדיקטור לגילוי.
הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לבדיקת איכות המים באמצעות אורגניזמים מחוון. עכשיו אתה צריך להבין איך לבדוק דגימות מים עבור E. coli ו coliforms אחרים, וכיצד לכמת את מידת הזיהום הנוכחי. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
אורגניזמים אינדיקטור מועסקים כדי לקבוע במהירות ובזול זיהום סביבתי. בדיקות קולירט משמשות לניתוח איכות המים עבור מקורות שתייה, פנאי ושפכים. איכות המים חייבת לעמוד בסטנדרטים משפטיים שנקבעו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה (EPA) ומחלקות הרגולציה של המדינה על מנת להתקבל כמשאב לצריכה אנושית ו/או סביבתית.
בדיקות קולירט משמשות גם מבחינה אסטרטגית כסמני איזון המוניים במחקר סביבתי, וניתן לנתח נתונים אלה יחד עם בדיקות סביבתיות אחרות כדי למדוד את המתאם בין התוצאות. ביצוע בדיקת P-A Colilert פשוטה נותן אינדיקציה אם מדגם מזוהם, אשר ניתן לנתח לצד תוצאות המחקר. אם מדגם P-A מראה כי יש זיהום במים, אז דגימות המים בשימוש במחקר עשוי להיות גם זיהום שמוביל לתוצאות לא ברורות, בעוד מגש MPN Quanti מספק כימות בסיסי עבור זיהום הנוכחי. לדוגמה, ניתן להשתמש באורגניזמים המחוון כדי לתאם כימותי מחוון עם מספר הפתוגנים שנמצאו בדגימת מים. אם מגש quanti מונה מספרי אינדיקטור נמוכים, זה מרמז כי מדגם המים צריך גם לחוות מגמות דומות עם רמות פתוגן נמוכות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
