Overview
Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz
Les champignons sont des organismes eucaryotes hétérotrophes et à l’exception des levures, sont aérobies. Ils sont abondants dans les sols de surface et sont importants pour leur rôle dans le cycle des éléments nutritifs et la décomposition des matières organiques et les contaminants organiques. Blanc de champignons (phanerochaete chryosporium) par exemple, (Figure 1) sont connus pour dégrader des composés aromatiques de la pourriture.
La figure 1. Blanc de pourriture sur le bouleau.
Principles
Les sols contiennent généralement des millions de champignons par gramme, donc le sol est généralement dilué à l’aide d’une série de dilutions. Une série de dilution est faite en suspendant une quantité donnée de sol dans une solution de dispersion, tels que de l’eau désionisée. Les aliquotes des suspensions sont ensuite transférées à la nouvelle solution, jusqu'à ce que la suspension est suffisamment diluée pour permettre des colonies fongiques discrètes à croître sur les géloses. (Figure 2)
Après l’inoculation sur plusieurs boîtes de gélose répétées, les boîtes sont incubées à 25 ° C. Après que les colonies de champignons macroscopiques sont formés, ils sont comptés, comme illustré à la Figure 3. L’hypothèse étant qu’une colonie fongique est dérivé d’un organisme, le terme d' Unités formant colonies (UFC) est utilisée en fin de compte, les résultats exprimés en termes d’UFC par gramme de sol sec du four.
Comtes de fongiques cultivables normales d’un sol fertile sont de l’ordre de 106-106 « propagules fongiques » (spores, hyphes ou fragments d’hyphes) par gramme de sol sec. Dénombrements cultivables ont été utilisés pour l’énumération des organismes depuis le XIXe siècle. Ils continuent d’être utilisés aujourd'hui, car ils sont peu coûteux à réaliser, nécessite peu de travail, sont rapides et sont assez reproductibles. Toutefois, ils souffrent d’un certain nombre d’erreurs qui doivent être considérés lorsqu’on évalue les résultats. Le plus important de ces erreurs est le fait que beaucoup d’organismes n'est pas culture sur plaques de médias.
Figure 2. Dilution et la technique de placage. Ici, la suspension de sol dilué est incorporée directement dans le milieu gélosé, plutôt que de surface appliqué à l’instar de l’électrodéposition de propagation. De environnement & Pollution Science, 2ème éd., Academic Press, San Diego, CA
Figure 3. Sur le sol des champignons isolés d’un sol de surface cultivé dans une boîte de Pétri contenant du Rose Bengale Agar. Photo courtoisie K.L. Josephson. De environnement & Pollution Science, 2ème éd., Academic Press, San Diego, Californie.
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Procedure
1. préparation des échantillons du sol
- Tout d’abord, déterminer la teneur en eau initiale du sol par une nuit de séchage d’une quantité connue de la terre humide, réexaminant et le sol sec. L’équation pour déterminer la teneur en eau initiale du sol est :
(Équation 1)
où :
MC = teneur en eau
W = poids net
D = poids sec - Calculer la quantité d’eau qui doit être ajoutée à 25 g de sol pour augmenter la teneur en humidité du sol à 10 % sur la base du poids sec.
- Ensuite, ajoutez la quantité d’eau à 25 g du sol.
- Couvrir le récipient d’une pellicule plastique et percer le film plusieurs fois avec une sonde pour permettre l’aération pendant l’incubation. Fixez le film avec une bande élastique.
- Peser le sol, puis envelopper Incuber l’échantillon à la température ambiante pendant une semaine.
2. l’incubation et l’Inoculation champignon
- Après que l’incubation est terminée, peser l’échantillon de sol avec l’enveloppe et la bande de caoutchouc. Calculer la perte de poids en raison de la perte d’humidité.
- Calculer la teneur en humidité du sol nouveau.
- Ensuite, préparer une série de dilution au 1/10 des sols tel qu’illustré à la Figure 2. Cela se traduira par des dilutions de 10-1 (bouteille à), 10-2 (tube B), 10-3 (tube C), 10-4 (tube D) et 10-5 (tube E) g de sol par des suspensions de mL.
- Préparer stérile Rose Bengale-streptomycine géloses. Le Rose Bengale et streptomycine inhibent la croissance bactérienne. Pour les sols très fertiles où les populations microbiennes du sol sont élevées, les dilutions choisies devraient être plus élevées, c'est-à-dire, 10-3, 10-4et 10-5, g de sol par plaque.
- À chacun de la 10-3 assiettes, ajouter 0,1 mL de la dilution tube 10-2, et réparties sur la surface de la gélose à l’aide d’une flamme ethanol stérilisé épandeur de verre. Parce qu’une quantité de 0,1 mL est plaquée, ce qui rend l' efficace dilution 10-3. Répétez ces étapes pour toutes les dilutions.
- Incuber les plaques à température ambiante pendant une semaine.
3. colonie comptant et l’examen par microscopie
- Faire des comptages de colonies à un seul et même dilution de chaque sol. Les plaques qui sont comptées devraient avoir des colonies dénombrables discrets. Recouvert de plaques ne devraient pas être comptées. De même, les plaques avec moins de 10 colonies ne devraient pas être comptées. Notez et décrire les caractéristiques culturelles de trois différentes colonies.
- Préparer pression ruban (ruban transparent) bâtis sur des lames de microscope détaillée étude utilisant la procédure suivante :
- Déposer une goutte de lactophénol montage fluide au centre d’une lame de verre propre
- Coupez une bande de ruban de cellophane clair environ 3 cm de long du rouleau de stock. Pour éviter de contaminer la surface adhésive, utiliser la pince lors de la manipulation de la bande. Une aiguille dissection aidera à libérer le ruban de la pince.
- Le côté adhésif du ruban adhésif est appliqué à la surface d’une colonie de champignon sporulant. Prendre soin d’éviter une pression excessive sur la bande ou une masse trop dense d’hyphes et les spores seront recueillies.
- Retirez la bande de contact avec la colonie de champignon et appliquez-le, côté adhésif vers le bas, la goutte de liquide de montage sur la lame de verre. Frottez doucement la bande avec un instrument lisse et plat à bulles d’air express.
- Examiner le support de bande au microscope sous l’objectif à immersion d’huile avec de l’huile.
- Identifier les deux genres de champignons différents, à l’aide de la clé d’identification fongique fournis (Figure 4).
La figure 4. « « « « Clé d’identification fongique.
Champignons filamenteux sont des organismes eucaryotes multicellulaires souvent trouvés en grand nombre dans le sol, jouant un rôle important dans l’écosystème. Champignons peuvent être isolés, quantifiés et examinés en laboratoire.
Les champignons sont abondants dans les sols de surface et jouent des rôles importants dans le cyclisme nutritif et la décomposition de matière organique et de contaminants. Étant incapables de synthétiser leur propre nourriture ils sont classés comme hétérotrophes aérobies et sont donc ont besoin d’oxygène.
Aux champignons de culture, sols échantillons sont dilués à des concentrations connues dans l’eau stérile, puis ensemencés sur la gélose et incubés. Les colonies fongiques qui en résulte peuvent ensuite être comptés et identifiés.
Cette vidéo illustre les principes qui sous-tendent l’isolement, quantification et identification des champignons filamenteux.
Les sols contiennent généralement des millions de champignons par gramme ; par conséquent, dilutions en série sont utilisées pour préparer des échantillons de sol pour l’analyse. Une quantité donnée de sol est ajoutée à une solution de dispersion. Des parties aliquotes de la suspension sont transférés à une solution de tampon en série jusqu'à ce que la suspension est diluée suffisamment pour permettre des colonies fongiques isolées à se développer.
Ces dilutions sont ensuite ensemencées sur milieux gélosés et incubées. Une fois qu’ils ont formé des colonies fongiques visibles, on peut compter. Comme il est supposé que chaque colonie fongique est dérivé d’un organisme unique, le terme d’unités formant colonies ou CFU, est utilisé pour exprimer le nombre d’organismes calculé par gramme de sol sec.
La plupart des champignons poussent comme des hyphes qui sont longs, ramification des structures qui sont le principal mode de croissance végétative. Les agrégations d’hyphes sont appelées mycélium. Les champignons peuvent également exister comme organismes unicellulaires, avec de la levure étant un exemple bien connu.
Reproduction fongique peut se produire de plusieurs façons. Produisant des hyphes de champignons peuvent se reproduisent asexuellement, en fragmentant les hyphes, ou des tiges avec des spores de semences-like. Champignons unicellulaires peuvent se reproduisent par voie asexuée par bourgeonnement.
Les champignons peuvent également se reproduire sexuellement. C’est moins fréquente que la reproduction asexuelle et se produit habituellement en réponse aux conditions environnementales défavorables. Producteurs des hyphes de champignons, deux hyphes reproducteurs de différentes souches fongiques peuvent fusionner, créant un zygote. Chez les champignons unicellulaires simples, deux cellules souches opposé seront fusible.
Sols fertiles contiennent normalement dans la gamme de 106 « propagules fongiques » par gramme de poids sec. Propagules sont les spores fongiques, hyphes ou fragments d’hyphes. À l’aide de dénombrements cultivables est une technique rapide, peu coûteuse et reproductible pour élucider le contenu fongique. Cependant, résultats peuvent être biaisés par le fait que pas tous les organismes seront culture sur plaques de médias.
Rose-Bengal géloses avec antibiotiques, tels que la streptomycine, sont généralement utilisés pour les cultures fongiques. Parce que les bactéries sont beaucoup plus nombreux que les champignons dans la plupart des sols, le média idéal fongique sélectionnera contre la croissance des bactéries tout en permettant les champignons pour survivre. Colorant rose-Bengal inhibe la croissance de la plupart des bactéries et réduit la taille des colonies fongiques. C’est idéal et empêche la prolifération de plaques fongiques ainsi que contrôler les bactéries.
Maintenant que nous sommes familiers avec les principes qui sous-tendent la mise en culture des champignons filamenteux, examinons un comment cela s’effectue en laboratoire.
Une fois que les échantillons de sol ont été prélevés, apportez-les au laboratoire pour analyse. Tout d’abord, calculer la teneur en humidité du sol. Ajouter de l’eau déionisée pour ramener la teneur en humidité à 15 %.
Les récipients d’une pellicule plastique et fixer avec une bande de caoutchouc pour limiter l’évaporation. Percer le film plusieurs fois afin de permettre l’aération.
Peser l’échantillon de sol et le récipient et le dossier. Incuber à température ambiante pendant une semaine permettre la croissance des champignons naturels.
Peser les échantillons de sol et le récipient et noter le poids. Calculer la perte de poids en raison de la perte d’humidité au cours de la semaine. Ajouter de l’eau sur le sol, pour ramener le poids à la valeur d’origine.
Ajouter 10 g de terre humide dans 95 mL d’eau distillée et mélanger soigneusement. Il s’agit de la dilution 10-1 10 g de sol ayant un volume de 5 mL environ. Effectuer quatre série de dilutions de 1 mL dans des flans 9 mL avec de l’eau de cette solution mère.
Ensuite, recueillir huit boîtes de gélose de Rose-Bengal-streptomycine stériles. Deux des plaques, ajouter 0,1 mL de la dilution tube 10-2et répartis sur la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur de verre flamme ethanol stérilisé. Parce qu’une quantité de 0,1 mL est plaquée, ce qui rend l' efficace dilution 10-3.
Ces incuber dans un placard sombre à température ambiante, pendant une semaine.
Après une semaine, compter les colonies distinctes dans chaque assiette. Plaques avec 10 à 20 colonies fongiques devraient être comptées. Notez et décrire les traits distinctifs des plaques ou colonies.
Prendre une lame de microscope de verre propre et déposer une goutte de lactophénol montage fluide dans le centre. À l’aide de pinces pour éviter toute contamination, coupez une bande de ruban adhésif transparent cellophane environ 3 cm de long. Si nécessaire, utilisez une aiguille dissection pour libérer le ruban de la pince.
Appliquez le côté adhésif du ruban adhésif sur la surface d’une colonie de champignon sporulant, prenant soin d’éviter une pression excessive. Ensuite, appliquez le côté adhésif du ruban avec échantillon de spore au liquide de montage sur la lame de verre. Frottez doucement la bande avec un instrument lisse et plat pour enlever les bulles d’air.
Examiner le montage de bande en vertu d’un objectif de grande puissant.
Les champignons peuvent être identifiés au microscope par l’examen des organes de fructification et spores. Une clé d’identification de champignons peut faciliter ce processus. Les types de champignons communs observés incluent Penicillium et Aspergillus.
En utilisant les plaques, les champignons peuvent être énumérées en utilisant la même technique qu’avec l’énumération bactérienne.
Identification et de culture de champignons sont utile pour diverses applications scientifiques.
Industries comme les pâtes et papiers produisant des installations peuvent utiliser des champignons filamenteux à dégrader le bois dans leur processus de fabrication de la pâte, dans une technique appelée biodésintégration. Les champignons tels que de la pourriture blanche peuvent dégrader copeaux efficacement, conduisant à une diminution de nécessité pour l’utilisation de la mise en pâte chimique ou mécanique.
Champignons peuvent également servir à briser d’autres matières, y compris certains types de plastiques biodégradables. Cela peut être utile pour des applications agricoles ou jardinage, où paillis biodégradable peuvent être utilisées pour créer des barrières temporaires à la croissance des plantes indésirables.
Les champignons sont également producteurs d’antibiotiques, composés qui a révolutionné la médecine au XXe siècle et continuent d’être une défense de première ligne dans l’infection aujourd'hui. La pénicilline, un antibiotique couramment, a été isolée des communes champignons filamenteux Penicillium rubens. Jusqu'à ce jour, les champignons filamenteux sont encore isolées et étudiés dans la recherche de nouveaux antibiotiques.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE de champignons filamenteux. Vous devez maintenant comprendre comment la culture de champignons filamenteux du sol, comment les quantifier et comment identifier les types de champignons communément trouvés dans le sol. Merci de regarder !
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Results
Dénombrement des colonies
Le nombre de colonies fongiques par gramme de sol est égal au nombre de colonies dénombrées sur la plaque, multipliée par l’inverse de la dilution. Par exemple, si 46 colonies sont dénombrées à une dilution de 10-5, puis l’UFC par gramme de sol est de 46 x 105 ou 4,6 x 106.
Identification de trois différents genres fongiques
Les champignons peuvent être identifiés au microscope par l’examen des organes de fructification et spores. Une clé d’identification de champignons peut faciliter ce processus. (Figure 4) Les types de champignons communs observés incluent Penicillium et Aspergillus.
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Applications and Summary
Dilution et le placage des champignons du sol peuvent servir comme une indication de la santé d’un sol. Normalement, un sol fertile « sain » aura 105 à 106 champignons par gramme de sol. Il peut également être utilisé pour isoler les cultures pures de certains champignons, évaluées par la suite pour des propriétés spécifiques, telles que la capacité de dégrader les composés organiques. Ceux-ci peuvent être préjudiciables à l’instar des champignons de pourriture blanche ou bénéfique lorsque toxiques organiques sont dégradés par biodégradation. Autres utilisations des cultures pures de champignons comprennent l’isolement des champignons pour les antibiotiques. Par exemple, le premier antibiotique était jamais la pénicilline, produite par le champignon terricole Penicillium. Cela a été découvert par Sir. Alexander Fleming en 1929.
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References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
