Overview
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ
פטריות הן אורגניזמים אאוקריוטים הטרוטרופיים, למעט שמרים, הם אירוביים. הם שופעים בקרקעות פני השטח וחשובים לתפקידם ברכיבה על אופניים מזינים ופירוק של חומר אורגני ומזהמים אורגניים. פטריות ריקבון לבנות(phanerochaete chryosporium)למשל, (איור 1) ידועים להשפיל ארומטיקה.
איור 1. ריקבון לבן על ליבנה.
Principles
קרקעות מכילות בדרך כלל מיליוני פטריות לגרם, כך שהאדמה מדוללת בדרך כלל באמצעות סדרת דילול. סדרת דילול נעשית על ידי השעיית כמות נתונה של אדמה בתמיסת פיזור, כגון מים דה-יוינו. ההשעיות מועברות לפתרון טרי, עד שהמתלה מדולל מספיק כדי לאפשר למושבות פטריות נפרדות לגדול על לוחות אגר. (איור 2)
לאחר חיסון על כמה לוחות אגר לשכפל, הצלחות הם דגירה ב 25 °C (5 °F). לאחר יצירת המושבות הפטרייתיות המקרוסקופיות, הן נספרות, כפי שמוצג באיור 3. מכיוון שההנחה היא שמושבה פטרייתית אחת נגזרת מאורגניזם אחד, המונח יחידות יוצרות מושבה (יחידות יוצרות מושבה) משמש בניתוח הסופי, כאשר התוצאות באות לידי ביטוי במונחים של CFUs לגרם של אדמה יבשה בתנור.
ספירות פטרייתיות רגילות מאדמה פורייה נמצאות בטווח של 106-106 "מפיצים" פטרייתיים (נבגים, hyphae, או שברי hyphal) לכל גרם של אדמה יבשה. ספירת לוחות פולטורלית שימשה לספירת אורגניזמים מאז המאה התשע עשרה. הם ממשיכים לשמש גם היום, מכיוון שהם זולים לביצוע, דורשים מעט עבודה, הם מהירים, והם ניתנים לשחזור למדי. עם זאת, הם סובלים ממספר שגיאות, אשר יש לקחת בחשבון בעת הערכת התוצאות. המשמעותית ביותר של טעויות אלה היא העובדה כי אורגניזמים רבים לא תרבות על לוחות מדיה.
איור 2. טכניקת דילול ו ציפוי. כאן, השעיית הקרקע המדוללת משולבת ישירות במדיום אגר ולא להיות משטח מוחל כמו במקרה של ציפוי התפשטות. מדע הסביבה והזיהום, 2nd Ed., עיתונות אקדמית, סן דייגו, קליפורניה
איור 3. פטריות אדמה מבודדות מאדמת פני השטח הגדלה בצלחת פטרי המכילה את רוז בנגל אגר. התמונה באדיבות ק.ל. ג'וזפסון. ממדע הסביבה והזיהום, 2nd Ed., עיתונות אקדמית, סן דייגו, קליפורניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הכנת דגימת קרקע
- ראשית, לקבוע את תכולת הלחות הראשונית של הקרקע על ידי ייבוש בן לילה של כמות ידועה של האדמה לחה, ו reweigh על האדמה היבשה. המשוואה לקביעת תכולת הלחות הראשונית של האדמה היא:
(משוואה 1)
איפה:
MC = תכולת לחות
W = משקל נטו
D = משקל יבש - חשב את כמות המים שיש להוסיף ל 25 גרם של אדמה כדי להגדיל את תכולת הלחות הקרקע ל 10% על בסיס משקל יבש.
- לאחר מכן, להוסיף את כמות המים ל 25 גרם של הקרקע.
- לכסות את המיכל בניילון נצמד ולנקב את הסרט מספר פעמים עם בדיקה כדי לאפשר aeration במהלך הדגירה. אבטחו את הסרט עם גומייה.
- שוקלים את האדמה ועוטפים, ואז מדגירים את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך שבוע.
2. חיסון חנק ופטריות
- לאחר הדגירה הושלמה, לשקול את דגימת הקרקע עם העטיפה ואת הגומייה. לחשב את הירידה במשקל עקב ירידה בלחות.
- חשב את תכולת הלחות החדשה בקרקע.
- לאחר מכן, הכינו סדרת דילול של 1/10 של הקרקעות כפי שמוצג באיור 2. התוצאה תהיה דילול של 10-1 (בקבוק A), 10-2 (צינור B), 10-3 (צינור C), 10-4 (צינור D), ו 10-5 (צינור E) g קרקע לכל מתלים mL.
- הכינו צלחות אגר סטריליות של רוז בנגל-סטרפטומיצין. הן רוז בנגל והן סטרפטומיצין מעכבים צמיחה חיידקית. עבור קרקעות פוריות מאוד שבהן אוכלוסיות מיקרוביות הקרקע גבוהות, הדילול הנבחר צריך להיות גבוה יותר, כלומר,10-3,10-4, ו 10-5, אדמה g לכל צלחת.
- לכל אחתמ-10-3 הצלחות, הוסיפו 0.1 מ"ל מצינור דילול 10-2, והתפשטו על פני אגר באמצעות מפזר זכוכית מעוקר להבת אתנול. מכיוון שכמות של 0.1 מ"ל מצופה, זה הופך את הדילול היעיל 10-3. חזור על שלבים אלה עבור כל הדילולים.
- צלחות דגירה בטמפרטורת החדר במשך שבוע.
3. ספירת מושבות ובדיקה על ידי מיקרוסקופיה
- הפוך מושבה לספור באחד ורק דילול אחד של כל אדמה. הלוחיות שנספרות צריכות להיות מושבות דיסקרטיות שניתן לספור. אין לספור צלחות מגודלות. כמו כן, אין לספור לוחות עם פחות מ -10 מושבות. שים לב ותיאר את המאפיינים התרבותיים של שלוש מושבות שונות.
- הכן קלטת לחץ (סרט שקוף) טעינה על שקופיות למחקר מיקרוסקופ מפורט באמצעות ההליך הבא:
- הפקדת טיפה של נוזל הרכבה לקטופנול במרכז מגלשת זכוכית נקייה
- חותכים רצועה של סרט צלופן שקוף באורך של כ-3 ס"מ מגליל המניות. כדי למנוע זיהום משטח הדבק, השתמש במלקחיים בעת הטיפול בסרט. מחט ניתוח תסייע בשחרר את הקלטת מהמלקחיים.
- הצד הדביק של הסרט מוחל על פני השטח של מושבת פטריות מנקבת. יש להקפיד להימנע מלחץ מוגזם על הקלטת או צפופה מדי תיאסף מסה של הייפאה ונבגים.
- הסר את הקלטת ממגע עם מושבת הפטרייה ולהחיל אותו, צד דבק כלפי מטה, על טיפת נוזל הרכבה על שקופית הזכוכית. לשפשף את הקלטת בעדינות עם כלי חלק, שטוח כדי לבטא בועות אוויר.
- בדוק את הסרט הרכבה מיקרוסקופית תחת המטרה טבילת שמן עם שמן.
- זהה שני סוגים פטרייתיים שונים באמצעות מפתח הזיהוי הפטרייתי שסופק(איור 4).
איור 4. מפתח זיהוי פטרייתי.
פטריות נטיות הן אורגניזמים רב תאיים, אאוקריוטים שנמצאים לעתים קרובות במספרים גדולים בקרקע, וממלאים תפקיד חשוב במערכת האקולוגית. ניתן לבודד, לכמת ולבדוק פטריות במעבדה.
פטריות מצויות בשפע בקרקעות על פני השטח ומבצעות תפקידים חשובים ברכיבה על אופניים מזינים ופירוק של חומר אורגני ומזהמים. מאחר שאינם מסוגלים לסנתז את המזון שלהם הם מסווגים כהטרוטרופיים והם אירוביים ולכן זקוקים לחמצן.
לפטריות תרבות, דגימות הקרקע מדוללות בריכוזים ידועים למים סטריליים, ואז מצופות על לוחות אגר ודגרה. המושבות הפטרייתיות המתקבלות עשויות להיספר ולזוהות.
סרטון זה ימחיש את העקרונות העומדים מאחורי הבידוד, הכימות והזיהוי של פטריות חוטיות.
קרקעות מכילות בדרך כלל מיליוני פטריות לגרם; לכן, דילול סדרתי משמש בדרך כלל להכנת דגימות קרקע לניתוח. כמות נתונה של אדמה מתווספת לפתרון פיזור. עליקוטים של ההשעיה מועברים לפתרון חיץ בסדרה עד שהמתלים מדוללים מספיק כדי לאפשר למושבות פטרייתיות נפרדות לגדול.
דילולים אלה מצופים לאחר מכן על מדיה אגר ודגרה. ברגע שהם יצרו מושבות פטרייתיות גלויות, ניתן לספור אותם. כפי ההנחה היא כי כל מושבה פטרייתית נגזר אורגניזם יחיד, המונח יחידות יוצרות מושבה, או CFU של, משמש כדי לבטא את מספר האורגניזמים מחושבים לכל גרם של אדמה יבשה.
רוב הפטריות גדלות כהייפאה, שהן מבנים ארוכים ומסתעפים שהם המצב העיקרי של צמיחה וגטטיבית. צבירות של hyphae נקראים תפטיר. פטריות עשויות להתקיים גם כאורגניזמים חד-תאיים, כאשר שמרים הם דוגמה ידועה.
רבייה פטרייתית יכולה להתרחש באחת מכמה דרכים. פטריות המייצרות Hyphae יכולות להתרבות באופן א-מיני, על ידי פיצול hyphae, או מתוך גבעולים עם נבגים דמויי זרע. פטריות חד-תאיות עשויות להתרבות באופן א-מיני על ידי ניצנים.
פטריות יכולות גם להתרבות מינית. זה נפוץ פחות מאשר רבייה א-מינית, ובדרך כלל מתרחש בתגובה לתנאים סביבתיים שליליים. בפטריות המייצרות הייפאה, שני היפנות רבייה מזני פטריות שונים יכולים להתמזג וליצור זיגוטה. בפטריות חד-תאיות, שני תאים של זנים מנוגדים יתמזגו.
קרקעות פוריות מכילות בדרך כלל בטווח של 106 פטרייתי "propagules" לכל גרם של משקל יבש. ההפצות הן נבגים פטרייתיים, הייפה או שברי הייפאל. שימוש בספירת לוחות פולחן הוא טכניקה מהירה, זולה וניתן לשחזור כדי ל להחיות תוכן פטרייתי. עם זאת, התוצאות יכולות להיות מוטות על ידי העובדה כי לא כל האורגניזמים יהיה תרבות על לוחות מדיה.
צלחות אגר רוז-בנגלי עם אנטיביוטיקה, כגון סטרפטומיצין, משמשות בדרך כלל לתרבויות פטרייתיות. מכיוון שחיידקים רבים בהרבה מ לפטריות ברוב הקרקעות, המדיה הפטרייתית האידיאלית תבחר נגד צמיחה חיידקית תוך מתן אפשרות לפטריות לשרוד. צבע ורד-בנגלי מעכב את הצמיחה של רוב החיידקים, ומפחית את גודל המושבות הפטרייתיות. זה אידיאלי, ומונע גידול יתר של לוחות פטרייתיים, כמו גם שליטה חיידקים.
עכשיו שאנחנו מכירים את העקרונות שמאחורי פטריות חוטיות פולחניות, בואו נסתכל על איך זה מתבצע במעבדה.
לאחר שדגימות הקרקע נאספו, הביאו אותן למעבדה לניתוח. ראשית, לחשב את תכולת הלחות של הקרקע. מוסיפים מים דה-יוניים כדי להביא את תכולת הלחות ל-15%.
מכסים את המיכלים בניילון נצמד ומאובטחים בגומייה כדי להגביל את האידוי. לנקב את הסרט מספר פעמים כדי לאפשר aeration.
שקול את דגימת הקרקע ואת המיכל ולתעד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שבוע כדי לאפשר צמיחה של הפטריות הטבעיות.
לשקול מחדש את דגימות הקרקע ואת מיכל ולתעד את המשקל. חשב ירידה במשקל עקב ירידה בלחות במהלך השבוע. מוסיפים מים לאדמה, כדי להחזיר את המשקל לערך המקורי.
מוסיפים 10 גרם של אדמה לחה ל-95 מ"ל של מים מזוקקים ומערבבים היטב. זהו דילול10-1 מאז 10 גרם של אדמה יש נפח של בערך 5 מ"ל. בצע ארבעה דילולים טוריים של 1 מ"ל לתוך 9 mL ריק באמצעות מים מפתרון מלאי זה.
לאחר מכן, אספו שמונה צלחות אגר סטריליות של רוז-בנגל-סטרפטומיצין. לשתיים מהצלחות, מוסיפים 0.1 מ"ל מצינור דילול10-2, ומתפרסים על פני אגר באמצעות מפזר זכוכית מעוקר להבת אתנול. מכיוון שכמות של 0.1 מ"ל מצופה, זה הופך את הדילול היעיל 10-3.
לדגור על הצלחות האלה בארון חשוך בטמפרטורת החדר, במשך שבוע.
לאחר שבוע, לספור את המושבות הדיסרטיות על כל צלחת. יש לספור צלחות עם 10 עד 20 מושבות פטרייתיות. שים לב ותיאר תכונות ייחודיות של הלוחות או המושבות.
קח שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה ולהפקיד טיפה של נוזל הרכבה לקטופנול למרכז. באמצעות מלקחיים כדי למנוע זיהום, לחתוך רצועה של סרט צלופן ברור על 3 ס"מ ארוך. במידת הצורך, השתמש במחט מנתחת כדי לשחרר את הקלטת מהמלקחיים.
החל את הצד הדבק של הסרט על פני השטח של מושבת פטריות מporulating, דואג למנוע לחץ מוגזם. לאחר מכן, החל את הצד הדבק של הסרט עם דגימת נבג על נוזל הרכבה על שקופית הזכוכית. לשפשף את הקלטת בעדינות עם כלי חלק, שטוח כדי להסיר בועות אוויר.
בחן את הרכב הקלטת תחת מטרה רבת עוצמה.
פטריות ניתן לזהות מיקרוסקופית על ידי בדיקה של גופי הפרי ואת הנבגים. מפתח זיהוי פטריות יכול לסייע בתהליך זה. סוגי פטריות נפוצים שנצפו כוללים פניציליום ואספרגילוס.
באמצעות הצלחות, הפטריות ניתן למנות באותה טכניקה כמו עם הספירה החיידקית.
זיהוי ופטריות פולחן שימושיים למגוון יישומים מדעיים.
תעשיות כמו עיסת ונייר לייצר מתקנים עשויים להשתמש פטריות חוטים כדי להשפיל עץ בתהליך העיוץ שלהם, בטכניקה המכונה ביו-פולינג. פטריות כגון ריקבון לבן עלולות לבזות שבבי עץ ביעילות, מה שמוביל לירידה בצורך בשימוש בחבטות כימיות או מכניות.
פטריות יכולות לשמש גם כדי לשבור חומרים אחרים, כולל סוגים מסוימים של פלסטיק מתכלה. זה יכול להיות שימושי עבור יישומים חקלאיים או גינון, שבו סרטי קש מתכלה עשוי לשמש כדי ליצור מחסומים זמניים לצמיחת צמחים לא רצויים.
פטריות הן גם יצרניות של אנטיביוטיקה, תרכובות שחוללו מהפכה ברפואה במאה ה -20 וממשיכות להיות הגנה בחזית בזיהום כיום. פניצילין, אנטיביוטיקה נפוצה, היה מבודד מן הפטריות חוטים נפוצים פניציליום רובנס. עד היום, פטריות חוטיות עדיין מבודדות ונחקרות בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לפטריות נמהרות. עכשיו אתה צריך להבין איך תרבות פטריות חוטיות מהאדמה, איך לכמת אותם, וכיצד לזהות סוגים של פטריות בדרך כלל נמצא באדמה. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
מחוזות המושבה
מספר המושבות הפטרייתיות לגרם אדמה שווה למספר המושבות הנספרות על הלוח המוכפל על ידי ההדדיות של הדילול מצופה. לדוגמה, אם 46 מושבות נספרות בדילול של 10-5, אז CFU לגרם של אדמה הוא 46 x 105 או 4.6 x 106.
זיהוי של שלושה סוגים פטרייתיים שונים
פטריות ניתן לזהות מיקרוסקופית על ידי בדיקה של גופי הפרי ואת הנבגים. מפתח זיהוי פטריות יכול לסייע בתהליך זה. (איור 4) סוגי פטריות נפוצים שנצפו כוללים פניציליום ואספרגילוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
דילול ו ציפוי של פטריות קרקע יכול לשמש אינדיקציה לבריאות של אדמה. בדרך כלל אדמה פורייה "בריאה" תהיה 105 עד 106 פטריות לכל גרם של אדמה. זה יכול גם להיות מנוצל כדי לבודד תרבויות טהורות של פטריות ספציפיות, לאחר מכן מוערך עבור תכונות ספציפיות, כגון היכולת לבזות תרכובות אורגניות. אלה יכולים להיות מזיקים כמו במקרה של פטריות ריקבון לבן, או מועיל כאשר אורגנים רעילים מושפלים באמצעות מתכלה. שימושים אחרים של תרביות טהורות של פטריות כוללים בידוד של פטריות לאנטיביוטיקה. לדוגמה, האנטיביוטיקה הראשונה אי פעם היה פניצילין, המיוצר על ידי פטרייה המועברת בקרקע פניציליום. זה התגלה לראשונה על ידי סר אלכסנדר פלמינג בשנת 1929.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
