Overview
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz
I funghi sono organismi eucariotici eterotrofici e, ad eccezione dei lieviti, sono aerobici. Sono abbondanti nei terreni superficiali e sono importanti per il loro ruolo nel ciclo dei nutrienti e nella decomposizione della materia organica e dei contaminanti organici. I funghi marciume bianchi (phanerochaete chryosporium) per esempio, (Figura 1) sono noti per degradare gli aromatici.
Figura 1. Marciume bianco su betulla.
Principles
I terreni contengono generalmente milioni di funghi per grammo, quindi il terreno viene in genere diluito utilizzando una serie di diluizione. Una serie di diluizione viene effettuata sospendendo una data quantità di terreno in una soluzione dispersiva, come l'acqua deionizzata. Le aliquote delle sospensioni vengono quindi trasferite in soluzione fresca, fino a quando la sospensione non viene diluita sufficientemente da consentire alle singole colonie fungine discrete di crescere sulle piastre di agar. (Figura 2)
Dopo l'inoculazione su diverse piastre di agar replicate, le piastre vengono incubate a 25 °C. Dopo che le colonie fungine macroscopiche si sono formate, vengono contate, come mostrato nella Figura 3. Poiché l'ipotesi è che una colonia fungina sia derivata da un organismo, il termine Unità formanti colonie (CFU) viene utilizzato in analisi finale, con i risultati espressi in termini di CFU per grammo di terreno secco del forno.
I normali conteggi fungini coltivabili dal terreno fertile sono nell'intervallo di 106-10 6 "propaguloli" fungini (spore, ife o frammenti ifali) per grammo di terreno asciutto. I conteggi delle piastre coltivabili sono stati utilizzati per enumerare gli organismi dal diciannovesimo secolo. Continuano ad essere utilizzati oggi, in quanto sono poco costosi da eseguire, richiedono poco lavoro, sono veloci e sono abbastanza riproducibili. Tuttavia, soffrono di una serie di errori, che devono essere considerati quando si valutano i risultati. Il più significativo di questi errori è il fatto che molti organismi non si svilupperanno su piastre di supporto.
Figura 2. Tecnica di diluizione e placcatura. Qui, la sospensione del terreno diluito viene incorporata direttamente nel mezzo agar piuttosto che essere applicata in superficie come nel caso della placcatura diffusa. Da Environmental & Pollution Science, 2nd Ed., Academic Press, San Diego, CA
Figura 3. Funghi del suolo isolati da un terreno superficiale coltivato in una capsula di Petri contenente Rose Bengal Agar. Foto per gentile concessione di K.L. Josephson. Da Environmental & Pollution Science, 2nd Ed., Academic Press, San Diego, CA.
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Procedure
1. Preparazione del campione di terreno
- In primo luogo, determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno mediante essiccazione notturna di una quantità nota di terreno umido e ripesatura del terreno essiccato. L'equazione per determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno è:
(Equazione 1)
dove:
MC = contenuto di umidità
W = peso netto
D = peso a secco - Calcola la quantità di acqua che deve essere aggiunta a 25 g di terreno per aumentare il contenuto di umidità del suolo al 10% su una base di peso secco.
- Quindi, aggiungi quella quantità di acqua a 25 g di terreno.
- Coprire il contenitore con pellicola trasparente e forare il film più volte con una sonda per consentire l'aerazione durante l'incubazione. Fissare il film con un elastico.
- Pesare il terreno e avvolgere, quindi incubare il campione a temperatura ambiente per una settimana.
2. Inoculazione e incubazione di funghi
- Al termine dell'incubazione, pesare il campione di terreno con l'involucro e l'elastico. Calcola la perdita di peso dovuta alla perdita di umidità.
- Calcola il nuovo contenuto di umidità del suolo.
- Quindi, preparare una serie di diluizione 1/10 dei terreni come mostrato nella Figura 2. Ciò comporterà diluizioni di 10-1 (bottiglia A), 10-2 (tubo B), 10-3 (tubo C), 10-4 (tubo D) e 10-5 (tubo E) g di terreno per mL di sospensioni.
- Preparare piatti sterili di agar Rose Bengal-streptomycin. Sia il Rose Bengal che la streptomicina inibiscono la crescita batterica. Per terreni molto fertili dove le popolazioni microbiche del suolo sono elevate, le diluizioni scelte dovrebbero essere più alte, cioè10-3,10-4e 10-5,g di terreno per piatto.
- A ciascuna delle 10-3 piastre, aggiungere 0,1 ml dal tubo di diluizione 10-2e distribuire sulla superficie dell'agar utilizzando uno spandi vetro sterilizzato a fiamma di etanolo. Poiché una quantità di 0,1 ml è placcata, questo rende la diluizione effettiva 10-3. Ripetere questi passaggi per tutte le diluizioni.
- Incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.
3. Conteggio delle colonie ed esame al microscopio
- Fai in modo che le colonie contino a una e una sola diluizione di ciascun terreno. Le piastre che vengono contate dovrebbero avere colonie numerabili discrete. I piatti troppo cresciuti non dovrebbero essere contati. Allo stesso modo, le piastre con meno di 10 colonie non dovrebbero essere contate. Nota e descrivi le caratteristiche culturali di tre diverse colonie.
- Preparare i supporti a nastro a pressione (nastro trasparente) su vetrini per lo studio dettagliato del microscopio utilizzando la seguente procedura:
- Depositare una goccia di liquido di montaggio lattofenolo al centro di un vetrino pulito
- Tagliare una striscia di nastro di cellophane trasparente lunga circa 3 cm dal rotolo di scorta. Per evitare di contaminare la superficie adesiva, utilizzare una pinetta durante la manipolazione del nastro. Un ago di dissezione aiuterà a liberare il nastro dalla pinzetta.
- Il lato adesivo del nastro viene applicato sulla superficie di una colonia di funghi sporulanti. Fare attenzione ad evitare una pressione eccessiva sul nastro o una massa troppo densa di ife e spore verrà raccolta.
- Rimuovere il nastro dal contatto con la colonia di funghi e applicarlo, lato adesivo verso il basso, alla goccia di fluido di montaggio sul vetrino. Strofinare delicatamente il nastro con uno strumento liscio e piatto per esprimere bolle d'aria.
- Esaminare il supporto del nastro microscopicamente sotto l'obiettivo di immersione dell'olio con olio.
- Identificare due diversi generi fungini utilizzando la chiave di identificazione fungina fornita (Figura 4).
Figura 4. Chiave di identificazione fungina.
I funghi filamentosi sono organismi eucariotici multicellulari che si trovano spesso in gran numero nel suolo, svolgendo un ruolo importante nell'ecosistema. I funghi possono essere isolati, quantificati ed esaminati in laboratorio.
I funghi sono abbondanti nei terreni superficiali e svolgono ruoli importanti nel ciclo dei nutrienti e nella decomposizione della materia organica e dei contaminanti. Non essendo in grado di sintetizzare il proprio cibo sono classificati come eterotrofi e sono aerobici e quindi richiedono ossigeno.
Per la coltura di funghi, i campioni di terreno vengono diluiti a concentrazioni note in acqua sterile, quindi placcati su piastre di agar e incubati. Le colonie fungine risultanti possono quindi essere contate e identificate.
Questo video illustrerà i principi alla base dell'isolamento, della quantificazione e dell'identificazione dei funghi filamentosi.
I terreni contengono generalmente milioni di funghi per grammo; pertanto, le diluizioni seriali sono comunemente utilizzate per preparare campioni di terreno per l'analisi. Una data quantità di terreno viene aggiunta a una soluzione disperdente. Le aliquote della sospensione vengono trasferite in una soluzione tampone in serie fino a quando la sospensione non viene diluita abbastanza da consentire la crescita di colonie fungine discrete.
Queste diluizioni vengono poi placcate su mezzi di agar e incubate. Una volta che hanno formato colonie fungine visibili, possono essere contati. Poiché si presume che ogni colonia fungina sia derivata da un singolo organismo, il termine Unità formanti colonie, o CFU, viene utilizzato per esprimere il numero di organismi calcolato per grammo di terreno asciutto.
La maggior parte dei funghi cresce come ife, che sono strutture lunghe e ramificate che sono la principale modalità di crescita vegetativa. Le aggregazioni di ife sono indicate come micelio. I funghi possono anche esistere come organismi unicellulari, con il lievito che è un esempio ben noto.
La riproduzione fungina può avvenire in uno dei diversi modi. I funghi che producono ife possono riprodursi asessualmente, frammentando le ife o da gambi con spore simili a semi. I funghi unicellulari possono riprodursi asessualmente per gemma.
I funghi possono anche riprodursi sessualmente. Questo è meno comune della riproduzione asessuata e di solito si verifica in risposta a condizioni ambientali sfavorevoli. Nei funghi che producono ife, due ife riproduttive di diversi ceppi fungini possono fondersi, creando uno zigote. Nei funghi unicellulari, due cellule di ceppi opposti si fonderanno.
I terreni fertili contengono normalmente nell'intervallo di10 6 "propaguloli" fungini per grammo di peso secco. I propaguloli sono spore fungine, ife o frammenti ifali. L'utilizzo di conteggi di piastre coltivabili è una tecnica rapida, economica e riproducibile per chiarire il contenuto fungino. Tuttavia, i risultati possono essere distorti dal fatto che non tutti gli organismi si svilupperanno su piastre di supporto.
Le piastre di agar rosa-Bengala con antibiotici, come la streptomicina, sono tipicamente utilizzate per le colture fungine. Poiché i batteri sono molto più numerosi dei funghi nella maggior parte dei terreni, il mezzo fungino ideale selezionerà contro la crescita batterica consentendo ai funghi di sopravvivere. Il colorante Rosa-Bengala inibisce la crescita della maggior parte dei batteri e riduce le dimensioni delle colonie fungine. Questo è l'ideale e previene la crescita eccessiva di piastre fungine e controlla i batteri.
Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base della coltivazione di funghi filamentosi, diamo un'occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.
Una volta raccolti i campioni di terreno, portarli in laboratorio per l'analisi. Innanzitutto, calcola il contenuto di umidità del terreno. Aggiungere acqua deionizzata per portare il contenuto di umidità al 15%.
Coprire i contenitori con pellicola trasparente e fissare con un elastico per limitare l'evaporazione. Forare il film più volte per consentire l'aerazione.
Pesare il campione di terreno e il contenitore e registrare. Incubare a temperatura ambiente per una settimana per consentire la crescita dei funghi presenti in natura.
Ripresare i campioni di terreno e il contenitore e registrare il peso. Calcola la perdita di peso dovuta alla perdita di umidità durante la settimana. Aggiungere acqua al terreno, per riportare il peso al valore originale.
Aggiungere 10 g di terreno umido a 95 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente. Questa è la diluizione10 -1 poiché 10 g di terreno hanno un volume di circa 5 ml. Eseguire quattro diluizioni seriali da 1 mL in spazi vuoti da 9 mL utilizzando l'acqua di questa soluzione stock.
Quindi, raccogliere otto piastre sterili di agar Rose-Bengal-streptomycin. A due delle piastre, aggiungere 0,1 ml dal tubo di diluizione 10-2e distribuire sulla superficie dell'agar utilizzando uno spandi vetro sterilizzato a fiamma di etanolo. Poiché una quantità di 0,1 ml è placcata, questo rende la diluizione effettiva 10-3.
Incubare queste piastre in un armadio buio a temperatura ambiente, per una settimana.
Dopo una settimana, contare le colonie discrete su ogni piatto. Le piastre con 10-20 colonie fungine dovrebbero essere contate. Nota e descrivi le caratteristiche distintive delle piastre o delle colonie.
Prendi un vetrino per microscopio di vetro pulito e deposita una goccia di liquido di montaggio del lattofenolo al centro. Usando una pinna per evitare la contaminazione, tagliare una striscia di nastro di cellophane trasparente lunga circa 3 cm. Se necessario, utilizzare un ago di dissezione per liberare il nastro dalla pinzetta.
Applicare il lato adesivo del nastro sulla superficie di una colonia di funghi sporulanti, avendo cura di evitare una pressione eccessiva. Quindi, applicare il lato adesivo del nastro con campione di spore sul fluido di montaggio sul vetrino. Strofinare delicatamente il nastro con uno strumento liscio e piatto per rimuovere le bolle d'aria.
Esaminare il montaggio su nastro sotto un obiettivo ad alta potenza.
I funghi possono essere identificati microscopicamente dall'esame dei corpi fruttiferi e delle spore. Una chiave di identificazione dei funghi può aiutare questo processo. I tipi di funghi comuni osservati includono Penicillium e Aspergillus.
Usando le piastre, i funghi possono essere enumerati usando la stessa tecnica dell'enumerazione batterica.
Identificare e coltivare funghi è utile per una varietà di applicazioni scientifiche.
Industrie come gli impianti di produzione di cellulosa e carta possono utilizzare funghi filamentosi per degradare il legno nel loro processo di polpa, in una tecnica nota come biopulping. Funghi come il marciume bianco possono degradare i trucioli di legno in modo efficiente, portando a una diminuzione della necessità di utilizzare pasta chimica o meccanica.
I funghi possono anche essere utilizzati per abbattere altri materiali, compresi alcuni tipi di plastica biodegradabile. Questo può essere utile per applicazioni agricole o di giardinaggio, dove i film di pacciamatura biodegradabili possono essere utilizzati per creare barriere temporanee alla crescita indesiderata delle piante.
I funghi sono anche produttori di antibiotici, composti che hanno rivoluzionato la medicina nel 20 ° secolo e continuano ad essere una difesa in prima linea nelle infezioni di oggi. La penicillina, un antibiotico ampiamente usato, è stata isolata dai comuni funghi filamentosi Penicillium rubens. Fino ad oggi, i funghi filamentosi sono ancora isolati e studiati nella ricerca di nuovi antibiotici.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE ai funghi filamentosi. Ora dovresti capire come colturare funghi filamentosi dal suolo, come quantificarli e come identificare i tipi di funghi che si trovano comunemente nel suolo. Grazie per l'attenzione!
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Results
Conteggi delle colonie
Il numero di colonie fungine per grammo di terreno è pari al numero di colonie contate sulla piastra moltiplicato per il reciproco della diluizione placcata. Ad esempio, se 46 colonie vengono contate a una diluizione di 10-5, allora il CFU per grammo di terreno è 46 x 105 o 4,6 x 106.
Identificazione di tre diversi generi fungini
I funghi possono essere identificati microscopicamente dall'esame dei corpi fruttiferi e delle spore. Una chiave di identificazione dei funghi può aiutare questo processo. (Figura 4) I tipi di funghi comuni osservati includono Penicillium e Aspergillus.
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Applications and Summary
La diluizione e la placcatura dei funghi del suolo possono essere utilizzate come indicazione della salute di un suolo. Normalmente un terreno fertile "sano" avrà da 105 a 106 funghi per grammo di terreno. Può anche essere utilizzato per isolare colture pure di funghi specifici, successivamente valutati per proprietà specifiche, come la capacità di degradare i composti organici. Questi possono essere dannosi come nel caso dei funghi di marciume bianco, o utili quando le sostanze organiche tossiche vengono degradate attraverso la biodegradazione. Altri usi di colture pure di funghi includono l'isolamento di funghi per antibiotici. Ad esempio, il primo antibiotico in assoluto è stata la penicillina, prodotta dal fungo penicilliumtrasmesso dal suolo . Questo fu scoperto per la prima volta da Sir. Alexander Fleming nel 1929.
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References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
