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Environmental Microbiology

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Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

Fungos são organismos eucarióticos heterotróficos, e com exceção das leveduras, são aeróbicos. São abundantes em solos superficiais e são importantes por seu papel no ciclismo de nutrientes e pela decomposição de matéria orgânica e contaminantes orgânicos. Fungos de podridão branco (phanerochaete chryosporium) por exemplo,(Figura 1) são conhecidos por degradar aromáticos.

Figure 1
Figura 1. Apodrecimento branco na bétula.

Principles

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Os solos geralmente contêm milhões de fungos por grama, de modo que o solo é tipicamente diluído usando uma série de diluição. Uma série de diluição é feita suspendendo uma determinada quantidade de solo em uma solução dispersante, como a água deionizada. As alíquotas das suspensões são então transferidas para uma solução fresca, até que a suspensão seja diluída o suficiente para permitir que colônias fúngicas discretas individuais cresçam nas placas de ágar. (Figura 2)

Após a inoculação em várias placas de ágar de réplica, as placas são incubadas a 25 °C. Após a formação das colônias fúngicas macroscópicas, elas são contadas, como mostra a Figura 3. Como a suposição é que uma colônia fúngica é derivada de um organismo, o termo Unidades formadoras de colônias (UFC) é usado na análise final, com os resultados expressos em termos de UFC por grama de solo seco do forno.

As contagens fúngicas culturable normais do solo fértil estão na faixa de 106-106 fúngicos "propagules" (esporos, hifas ou fragmentos de hifa) por grama de solo seco. A contagem de placas culturais tem sido usada para enumerar organismos desde o século XIX. Eles continuam a ser usados hoje, pois são baratos de realizar, exigem pouco trabalho, são rápidos e são bastante reprodutíveis. No entanto, eles sofrem de uma série de erros, que devem ser considerados na avaliação dos resultados. O mais significativo desses erros é o fato de que muitos organismos não culturam em placas de mídia.

Figure 2
Figura 2. Técnica de diluição e revestimento. Aqui, a suspensão do solo diluído é incorporada diretamente no meio do ágar, em vez de ser aplicada à superfície, como no caso do revestimento de propagação. De Environmental & Pollution Science, 2nd Ed., Academic Press, San Diego, CA

Figure 3
Figura 3. Fungos do solo isolados de um solo superficial cultivado em uma placa de Petri contendo Rose Bengal Agar. Foto cortesia K.L. Josephson. De Environmental & Pollution Science, 2nd Ed., Academic Press, San Diego, CA.

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Procedure

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1. Preparação da amostra do solo

  1. Primeiro, determine o teor inicial de umidade do solo secando durante a noite uma quantidade conhecida do solo úmido, e reweighing o solo seco. A equação para determinar o teor inicial de umidade do solo é:
    Equation 1
    (Equação 1)
    onde:
    MC = teor de umidade
    W = peso líquido
    D = peso seco
  2. Calcule a quantidade de água que deve ser adicionada a 25 g de solo para aumentar o teor de umidade do solo para 10% em uma base de peso seco.
  3. Em seguida, adicione essa quantidade de água a 25 g do solo.
  4. Cubra o recipiente com plástico e perfure o filme várias vezes com uma sonda para permitir a aeração durante a incubação. Segure o filme com um elástico.
  5. Pesar o solo e embrulhar, em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente por uma semana.

2. Inoculação e Incubação de Fungos

  1. Após a incubação completa, pese a amostra do solo com o envoltório e o elástico. Calcule a perda de peso devido à perda de umidade.
  2. Calcule o novo teor de umidade do solo.
  3. Em seguida, prepare uma série de diluição de 1/10 dos solos, como mostrado na Figura 2. Isso resultará em diluições de 10-1 (garrafa A), 10-2 (tubo B), 10-3 (tubo C), 10-4 (tubo D) e 10-5 (tubo E) g de solo por mL.
  4. Prepare placas estéreis de ágar rose bengal-streptomiccin. Tanto a Bengala Rosa quanto a estreptomicina inibem o crescimento bacteriano. Para solos muito férteis, onde as populações microbianas do solo são altas, as diluições escolhidas devem ser maiores, ou seja,10-3,10-4e 10-5, g solo por placa.
  5. Para cada uma das 10-3 placas, adicione 0,1 mL do tubo de diluição10-2, e espalhe-se sobre a superfície do ágar usando um espalhador de vidro esterilizado com chama de etanol. Como uma quantidade de 0,1 mL é banhada, isso torna a diluição efetiva 10-3. Repita estes passos para todas as diluições.
  6. Incubar placas em temperatura ambiente por uma semana.

3. Contagem e Exame de Colônia por Microscopia

  1. Faça colônia conta em um e apenas uma diluição de cada solo. As placas que são contadas devem ter discretas colônias contáveis. Placas overgrown não devem ser contadas. Da mesma forma, placas com menos de 10 colônias não devem ser contadas. Observe e descreva as características culturais de três colônias diferentes.
  2. Prepare os suportes de fita de pressão (fita transparente) em slides para estudo detalhado do microscópio usando o seguinte procedimento:
    1. Deposite uma gota de fluido de montagem de lactofenol no centro de um escorregador de vidro limpo
    2. Corte uma tira de fita de celofane clara a cerca de 3 cm de comprimento do rolo de estoque. Para evitar contaminar a superfície adesiva, use fórceps ao manusear a fita. Uma agulha dissecando ajudará a libertar a fita dos fórceps.
    3. O lado adesivo da fita é aplicado na superfície de uma colônia de fungos esporulando. Tome cuidado para evitar pressão excessiva na fita ou muito densa uma massa de hifa e esporos serão coletados.
    4. Remova a fita do contato com a colônia de fungos e aplique-a, lado adesivo para baixo, à gota de fluido de montagem na lâmina de vidro. Esfregue a fita suavemente com um instrumento liso e plano para expressar bolhas de ar.
    5. Examine o suporte da fita microscopicamente sob o objetivo de imersão do óleo com óleo.
    6. Identificar dois gêneros fúngicos diferentes utilizando a chave de identificação fúngica fornecida(Figura 4).

Figure 4
Figura 4. Chave de identificação fúngica.

Fungos filamentosos são organismos multicelulares e eucarióticos frequentemente encontrados em grande número no solo, desempenhando um papel importante no ecossistema. Os fungos podem ser isolados, quantificados e examinados em laboratório.

Os fungos são abundantes em solos superficiais e desempenham papéis importantes no ciclismo de nutrientes e na decomposição de matéria orgânica e contaminantes. Sendo incapazes de sintetizar sua própria comida, eles são classificados como heterotróficos e são aeróbicos e, portanto, requerem oxigênio.

Para os fungos da cultura, as amostras de solo são diluídas em concentrações conhecidas em água estéril, depois banhadas em placas de ágar e incubadas. As colônias fúngicas resultantes podem então ser contadas e identificadas.

Este vídeo ilustrará os princípios por trás do isolamento, quantificação e identificação de fungos filamentosos.

Os solos geralmente contêm milhões de fungos por grama; portanto, diluições seriais são comumente usadas para preparar amostras de solo para análise. Uma determinada quantidade de solo é adicionada a uma solução de dispersão. As alíquotas da suspensão são transferidas para uma solução tampão em série até que a suspensão seja diluída o suficiente para permitir que colônias fúngicas discretas cresçam.

Essas diluições são então banhadas em mídia de ágar e incubadas. Uma vez que eles formaram colônias fúngicas visíveis, eles podem ser contados. Como se supõe-se que cada colônia fúngica é derivada de um único organismo, o termo Unidades formadoras de colônias, ou CFU's, é usado para expressar o número de organismos calculados por grama de solo seco.

A maioria dos fungos cresce como hifa, que são estruturas longas e ramificadas que são o principal modo de crescimento vegetativo. Agregações de hifa são referidas como micélio. Fungos também podem existir como organismos unicelulares, sendo a levedura um exemplo bem conhecido.

A reprodução fúngica pode ocorrer de várias maneiras. Fungos produtores de jacó podem se reproduzir assexualmente, fragmentando hifas, ou de talos com esporos semelhantes a sementes. Fungos unicelulares podem se reproduzir assexuicamente brotando.

Fungos também podem se reproduzir sexualmente. Isso é menos comum do que a reprodução assexual, e geralmente ocorre em resposta a condições ambientais desfavoráveis. Em fungos produtores de hifa, duas hifas reprodutivas de diferentes cepas fúngicas podem se fundir, criando um zigoto. Em fungos unicelulares, duas células de cepas opostas se fundirão.

Solos férteis normalmente contêm na faixa de 106 "propagules" fúngicos por grama de peso seco. Propagules são esporos fúngicos, hifas ou fragmentos de higáfaco. O uso de placas culturable é uma técnica rápida, barata e reprodutível para elucidar conteúdo fúngico. No entanto, os resultados podem ser distorcidos pelo fato de que nem todos os organismos terão cultura nas placas de mídia.

Placas de ágar rosa-bengala com antibióticos, como a estreptomicina, são tipicamente usadas para culturas fúngicas. Como as bactérias são muito mais numerosas do que os fungos na maioria dos solos, a mídia fúngica ideal se selecionará contra o crescimento bacteriano, permitindo que os fungos sobrevivam. O corante rosa-bengala inibe o crescimento da maioria das bactérias, e reduz o tamanho das colônias fúngicas. Isso é ideal, e previne o crescimento excessivo de placas fúngicas, bem como o controle de bactérias.

Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da cultura de fungos filamentosos, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.

Uma vez coletadas as amostras de solo, leve-as ao laboratório para análise. Primeiro, calcule o teor de umidade do solo. Adicione água deionizada para elevar o teor de umidade para 15%.

Cubra os recipientes com plástico e fixe com um elástico para limitar a evaporação. Fure o filme várias vezes para permitir a aeração.

Pesar a amostra do solo e o recipiente e registrar. Incubar à temperatura ambiente por uma semana para permitir o crescimento dos fungos que ocorrem naturalmente.

Repesar as amostras de solo e recipiente e registrar o peso. Calcule a perda de peso devido à perda de umidade ao longo da semana. Adicione água ao solo, para trazer o peso de volta ao valor original.

Adicione 10 g de solo úmido a 95 mL de água destilada e misture bem. Esta é a diluição de 10-1 já que 10 g de solo tem um volume de aproximadamente 5 mL. Realize quatro diluições seriais de 1 mL em espaços em branco de 9 mL usando água desta solução de estoque.

Em seguida, colete oito placas estéreis rose-bengala-estreptomicina ágar. A duas das placas, adicione 0,1 mL do tubo de diluição10-2, e espalhe-se sobre a superfície do ágar usando um espalhador de vidro esterilizado com chama de etanol. Como uma quantidade de 0,1 mL é banhada, isso torna a diluição efetiva 10-3.

Incubar essas placas em um armário escuro à temperatura ambiente, por uma semana.

Depois de uma semana, conte as colônias discretas em cada prato. Placas com 10 a 20 colônias fúngicas devem ser contadas. Observe e descreva características distintas das placas ou colônias.

Pegue um slide de microscópio de vidro limpo e deposite uma gota de fluido de montagem de lactofenol no centro. Usando fórceps para evitar contaminação, corte uma tira de fita celofane clara de cerca de 3 cm de comprimento. Se necessário, use uma agulha dissecando para libertar a fita dos fórceps.

Aplique o lado adesivo da fita na superfície de uma colônia de fungos esporulando, tomando cuidado para evitar pressão excessiva. Em seguida, aplique o lado adesivo da fita com amostra de esporo no fluido de montagem no slide de vidro. Esfregue a fita suavemente com um instrumento liso e plano para remover bolhas de ar.

Examine a montagem da fita sob um objetivo de alta potência.

Os fungos podem ser identificados microscopicamente por meio do exame dos corpos e esporos frutíferos. Uma chave de identificação de fungos pode auxiliar nesse processo. Os tipos de fungos comuns observados incluem Penicillium e Aspergillus.

Utilizando as placas, os fungos podem ser enumerados usando a mesma técnica da enumeração bacteriana.

Identificar e aculturar fungos é útil para uma variedade de aplicações científicas.

Indústrias como instalações produtoras de celulose e papel podem usar fungos filamentosos para degradar a madeira em seu processo de polpa, em uma técnica conhecida como biopulping. Fungos como a podridão branca podem degradar os chips de madeira de forma eficiente, levando à diminuição da necessidade do uso de polpa química ou mecânica.

Fungos também podem ser usados para quebrar outros materiais, incluindo certos tipos de plásticos biodegradáveis. Isso pode ser útil para aplicações agrícolas ou de jardinagem, onde filmes de mulch biodegradáveis podem ser usados para criar barreiras temporárias ao crescimento indesejado das plantas.

Os fungos também são produtores de antibióticos, compostos que revolucionaram a medicina no século XX e continuam a ser uma defesa de linha de frente na infecção hoje. A penicilina, um antibiótico amplamente utilizado, foi isolada dos fungos filamentosos comuns Penicillium rubens. Até hoje, os fungos filamentosos ainda estão isolados e estudados na busca por novos antibióticos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE a fungos filamentosos. Agora você deve entender como cultivar fungos filamentosos do solo, como quantificá-los e como identificar tipos de fungos comumente encontrados no solo. Obrigado por assistir!

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Results

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Contagem de Colônias

O número de colônias fúngicas por grama de solo é igual ao número de colônias contadas na placa multiplicada pela recíproca da diluição banhada. Por exemplo, se 46 colônias forem contadas em uma diluição de 10-5, então a UFC por grama de solo é 46 x 105 ou 4,6 x 106.

Identificação de Três Gêneros Fúngicos Diferentes

Os fungos podem ser identificados microscopicamente por meio do exame dos corpos e esporos frutíferos. Uma chave de identificação de fungos pode auxiliar nesse processo. (Figura 4) Os tipos de fungos comuns observados incluem Penicillium e Aspergillus.

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Applications and Summary

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A diluição e o revestimento de fungos do solo podem ser usados como indicação da saúde de um solo. Normalmente, um solo fértil "saudável" terá de10 a 106 fungos por grama de solo. Também pode ser utilizado para isolar culturas puras de fungos específicos, posteriormente avaliados para propriedades específicas, como a capacidade de degradar compostos orgânicos. Estes podem ser prejudiciais como no caso de fungos de podridão branca, ou benéficos quando orgânicos tóxicos são degradados através da biodegradação. Outros usos de culturas puras de fungos incluem o isolamento de fungos para antibióticos. Por exemplo, o primeiro antibiótico foi a penicilina, produzida pelo fungo penicilliumtransportado pelo solo. Isto foi descoberto pela primeira vez por Sir. Alexander Fleming em 1929.

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References

  1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
  2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).

Transcript

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