Técnica aséptica en ciencias ambientales

El objetivo de la utilización de técnicas asépticas es crear y mantener un ambiente estéril de trabajo, equipos y reactivos, con el fin de minimizar la contaminación de las muestras biológicas. Para ello, el espacio de trabajo y algunas herramientas se pueden desinfectar con productos químicos como el etanol al 70% y diluir blanqueador. También es importante para el investigador a equipo de protección personal (EPP) como una bata, guantes, y gafas de seguridad.

Medios y reactivos pueden esterilizarse mediante filtro aparatos de esterilización que emplean filtros de 0.22 μm, que quita con eficacia la mayoría de los microorganismos como las bacterias. Por otra parte, muchos reactivos y equipos también se pueden esterilizar en calor alto. Por ejemplo, microbios o en herramientas, cristalería y medios líquidos pueden ser muerto de calor en una autoclave, que es una cámara que esteriliza el contenido vía la exposición a alta temperatura de vapor a presión. Además, algunas herramientas pueden ser esterilizados de calor usando una fuente de llama, como un mechero de Bunsen.

El uso de una fuente de fuego es también una de las maneras más comunes para establecer un ambiente de trabajo aséptico. El calor de la llama provoca convección del aire, generando una corriente ascendente que eleva cualquier contaminantes en el aire de las proximidades del quemador y la creación de un "campo estéril" en el que llevar a cabo trabajo experimental aséptico.

1. preparación para el trabajo aséptico

1. Obtener y aplicar los siguientes elementos de la PPE: bata de laboratorio, guantes de látex o de nitrilo (sin desgarros o agujeros) y gafas de seguridad (figura 1). Para seguridad en caso de utilizar una llama abierta, atar el cabello largo.
   
   Figura 1: PPE: una bata de laboratorio, guantes de látex y gafas de seguridad.
2. Un segundo aspecto importante de la técnica aséptica es la correcta esterilización y almacenamiento de los medios de comunicación/reactivos a utilizarse en el laboratorio. Preparación de medio líquido caldo (p. ej., caldo de soja tríptica) y agar-medios de comunicación (p. ej., R2A) pesando la cantidad adecuada de polvo seco de la base, que se agrega a la cantidad apropiada de agua desionizada.
3. Para el medio de caldo disolver el polvo en un plato caliente con poco calor aplicado y dispensar el líquido en volúmenes de 100 mL en frascos de vidrio tapa de rosca o en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de vidrio tapa de rosca. Utilizando una barra de agitación magnética, agitar el medio de agarosa en el agitador de placa calefactora hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
4. Aplique cinta de autoclave a los envases y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante (p. ej., 20 min a 121 ° C) (figuras 2 y 3). Tenga en cuenta que el color de las rayas en la cinta de autoclave debe cambiar de blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave). Aunque el cambio de color indica generalmente que la esterilización fue exitosa, esterilidad comprueba utilizando kits de la tira de esporas puede llevarse a cabo para verificar el proceso de esterilización en autoclave.
   
   Figura 2: Cinta de Autoclave se aplica al material.
   
   Figura 3: Tenga en cuenta el cambio de color de las rayas en la cinta de autoclave del blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave).
5. Enfriar los caldos líquidos a temperatura ambiente y luego almacenar a temperatura ambiente o refrigerada a 4 ° C.
6. Enfriar el medio de agarosa colocando el recipiente en un baño de agua a 50 ° C. Una vez fríos, los medios de comunicación se pueden verter en placas de Petri estériles. Permitir que el medio a enfriar y solidificar y consolidar almacenamiento bajo temperaturas especificadas por el fabricante.
7. Hay varias variedades de medios de cultivo que no puede ser esterilizado como las altas temperaturas degradan ingredientes críticos. Esterilizar estos requieren filtro de esterilización mediante un sistema de filtración de vacío empleando un filtro de 0,22 μm, seguido de almacenamiento a la temperatura adecuada.
8. Antes de realizar el trabajo en el Banco, desinfectar la superficie con una solución apropiada (p. ej., 500 ppm de cloro). Esto reduce el riesgo de transferencia de contaminantes de la superficie de trabajo para las culturas y medios estériles.
9. Para establecer un campo estéril, encender un mechero de Bunsen. El tipo de llama más adecuado para metal esterilización inoculación bucles es una llama azul intenso, con un cono azul definitivo en el centro (figura 4).
   
   Figura 4: Aislar a una transferencia de bacterias de una placa de Petri mostrando crecimiento de un cultivo a otro no inoculada placa de Petri conteniendo un medio de cultivo base de agar.
10. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la parte más caliente de la llama (punta del cono azul). El bucle debe virar a rojo caliente con el fin de esterilización.

2. traslados bacterianas: De placa de Petri para la placa de Petri

1. Un escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri mostrando crecimiento de una placa de Petri aislante a otro, estéril cultivada que contiene un medio de cultivo base de agar.
2. Para comenzar, abra ligeramente la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y golpee suavemente el asa de inoculación esterilizada, caliente sobre la superficie del agar.
3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
4. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
5. Para cada porción de la franja de aislamiento (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el asa justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde puede utilizar o entrar en contacto con las asas de inoculación.
6. Coloque las placas veteadas en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

3. bacterianas transferencias: Del caldo de cultivo en placa de Petri

1. Un segundo escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento general observado por turbidez a una placa de Petri estéril con medio de cultivo.
2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar a la apertura del envase x 2-3 a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
3. Baje con cuidado el asa de inoculación esterilizada en la cubeta de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo (figura 5) y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
   
   Figura 5: Un asa llena de caldo de cultivo.
5. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
6. Para cada parte de la raya (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el lazo justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
7. Coloque las placas de rayas para el aislamiento en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

4. bacterianas transferencias: De la placa de Petri con el crecimiento en medio líquido estéril de

1. Un tercer escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri que contienen una racha aislada cultura a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
2. Un poco abrir la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y enfriar el asa de inoculación caliente golpeando suavemente sobre la superficie del agar.
3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
4. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase 2 a 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa en la mesa.
5. Baje con cuidado la Colonia extraída en el medio líquido caldo y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
6. Llama-esterilizar el asa de inoculación para prevenir la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
7. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
8. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
9. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
10. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

5. transferencias bacterianas: De caldo de cultivo al medio de cultivo líquido estéril

1. Un cuarto escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
3. Cuidadosamente baje el asa de inoculación en el frasco de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
5. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
6. Cuidadosamente baje el asa llena extraído en el medio caldo líquido estéril y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
7. Llama-esterilizar el asa de inoculación (figura 6) con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
   
   Figura 6: Inocular lazo rojo que da vuelta caliente mientras se esterilizan con un mechero de Bunsen.
8. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
9. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
10. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
11. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

El resultado del procedimiento demuestra la técnica aséptica adecuada y mala técnica aséptica. Figura 7 muestra la contaminación que puede surgir de la mala técnica aséptica al verter a las placas de agarosa (top placa: medio estéril; las placas inferiores: contaminados de los medios de comunicación).

Figura 7: contaminación que puede surgir de la mala técnica aséptica al verter a las placas de agarosa. Superior de la placa: medio estéril; platos de fondo: contaminados de los medios de comunicación.

Que no mecheros Bunsen, entornos de trabajo aséptico se pueden mantener también en estaciones de trabajo especializadas conocidas como campanas de flujo laminar, que el uso dirigido de flujo de aire y filtros para mantener la esterilidad.

El uso correcto de la técnica aséptica es vital para microbiólogos ambientales cuando se muestreo en el campo y en el laboratorio cuando se trabaja con los medios, reactivos y cultivados aislados.  Mala técnica aséptica en el campo puede resultar en la transferencia de microorganismos de muestras ambientales críticas al técnico, así como la contaminación de microbios de una muestra a otra. Este tipo de eventos es de importancia, por ejemplo, en estudios de ecología microbiana que buscan identificar y comparar las poblaciones de bacterias y hongos que pueden estar presentes en un bioma dado. Contaminación de estas muestras puede resultar en una pérdida de integridad de los datos. Técnica aséptica también es crítica para el mantenimiento de cepas de laboratorio procedentes de muestreo de campo o desde los repositorios de cultura microbianas y celular bien establecidas. El tiempo, el trabajo y el costo financiero que se requiere de un laboratorio en un esfuerzo por "limpiar" o reemplazar cultivos contaminados, particularmente raros aislados de ambientes únicos, podría ser muy elevado y prohibitivo, como algunos aislamientos pueden ser irremplazables.