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Técnica Asséptica em Ciência Ambiental

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

A técnica asséptica é uma habilidade fundamental amplamente praticada no campo da microbiologia ambiental que requer um equilíbrio de atenção plena e prática em laboratório. O uso adequado desta técnica reduz a probabilidade de contaminação bacteriana ou fúngica de reagentes, meios culturais e amostras ambientais. A técnica asséptica também é vital para garantir a integridade dos dados e manter a pureza das bibliotecas culturais que podem ser compostas por isolados muito raros e difíceis de cultura. As fontes de contaminação no ambiente laboratorial incluem microrganismos aéreos (incluindo aqueles que aderiram a partículas de poeira e fiapos), micróbios presentes no espaço de trabalho do banco de laboratório ou em vidros ou equipamentos não esterilizados, e micróbios transferidos do corpo e cabelo do pesquisador. O uso da técnica asséptica também é uma medida de segurança que reduz o potencial de transmissão de microrganismos aos pesquisadores, o que é particularmente importante quando se trabalha com patógenos.

Principles

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O objetivo do uso de técnicas assépticas é criar e manter um ambiente de trabalho estéril, equipamentos e reagentes, de modo a minimizar a contaminação de amostras biológicas. Para isso, o espaço de trabalho e algumas ferramentas podem ser desinfetados com produtos químicos como 70% de etanol e alvejante diluído. Também é importante que o pesquisador use equipamentos de proteção individual (EPI), como jaleco, luvas e óculos de segurança.

A mídia e os reagentes podem ser esterilizados usando aparelhos de esterilização de filtros que empregam filtros de 0,22 μm, que efetivamente removem a maioria dos microrganismos, como bactérias. Alternativamente, muitos reagentes e equipamentos também podem ser esterilizados em alto calor. Por exemplo, micróbios ligados ou em ferramentas, vidros e mídia líquida podem ser mortos pelo calor em uma autoclave, que é uma câmara que esteriliza o conteúdo através da exposição ao vapor pressurizado de alta temperatura. Além disso, algumas ferramentas podem ser esterilizadas pelo calor usando uma fonte de chama, como um queimador Bunsen.

O uso de uma fonte de chama também é uma das formas mais comuns de estabelecer um ambiente de trabalho asséptico. O calor da chama causa convecção de ar, gerando uma corrente ascendente que eleva qualquer contaminante aéreo para longe das proximidades do queimador, e criando um "campo estéril" para realizar um trabalho experimental asséptico.

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Procedure

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1. Preparação para o trabalho asséptico

  1. Obtenha e aplique os seguintes itens epi: jaleco, luvas de látex ou nitríis (livre de lágrimas ou orifícios) e óculos de segurança(Figura 1). Para segurança no caso de usar uma chama aberta, amarre o cabelo comprido.
    Figure 1
    Figura 1: EPI: Um jaleco, luvas de látex e óculos de segurança.
  2. Um segundo aspecto importante da técnica asséptica é a esterilização e armazenamento adequados de mídia/reagentes a serem utilizados em laboratório. Prepare o meio de caldo líquido (por exemplo,caldo de soja tripptic) e mídia à base de ágar (porexemplo,R2A) pesando a quantidade adequada de pó de base seca, que é adicionado à quantidade apropriada de água desionizada.
  3. Para o meio do caldo, dissolva o pó em uma placa quente com fogo baixo aplicado e dispense o líquido em volumes de 100 mL em frascos de vidro ou em volumes de 10 mL em tubos de teste de vidro. Com uma barra de mexida magnética, mexa o meio agarose no agitador de placa quente até que o pó esteja totalmente dissolvido.
  4. Aplique fita autoclave nos recipientes e autoclave a mídia de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo,20 min a 121 °C) (Figuras 2 e 3). Observe que a cor das listras na fita autoclave deve mudar de branco (pré-autoclave) para preto (pós-autoclave). Embora a mudança de cor geralmente indique que a esterilização foi bem sucedida, verificações de esterilidade usando kits de tiras de esporos podem ser realizadas para verificar o processo de autoclavagem.
    Figure 2
    Figura 2: Fita autoclave sendo aplicada ao material.
    Figure 3
    Figura 3: Observe a mudança de cor das listras na fita autoclave do branco (pré-autoclave) para o preto (pós-autoclave).
  5. Esfrie os caldos líquidos à temperatura ambiente e, em seguida, armazene à temperatura ambiente ou refrigerado a 4 °C.
  6. Esfrie o meio de agarose colocando o recipiente em um banho de água definido para ~50 °C. Uma vez resfriado, a mídia pode ser derramada em pratos petri estéreis. Deixe o meio esfriar e solidificar e, em seguida, consolidar-se para armazenamento em temperaturas especificadas pelo fabricante.
  7. Existem várias variedades de meios de cultura que não podem ser autoclavadas à medida que as altas temperaturas degradam ingredientes críticos. Esterilização destes requer esterilização de filtros usando um sistema de filtragem de vácuo que emprega um filtro de 0,22 μm, seguido de armazenamento na temperatura apropriada.
  8. Antes de realizar o trabalho no banco, desinfete a superfície usando uma solução apropriada (por exemplo,alvejante de 500 ppm). Isso reduz o risco de transferência de contaminantes da superfície de trabalho para culturas e mídia estéril.
  9. Para estabelecer um campo estéril, ligue um bico bunsen. O tipo de chama mais adequado para esterilizar laços de inoculação metálica é uma chama azul intensa, com um cone azul definitivo observado no meio(Figura 4).
    Figure 4
    Figura 4: Uma transferência de bactérias de uma placa de Petri mostrando o crescimento de um isolado cultivado para outra placa petri não inoculada contendo um meio de crescimento à base de ágar.
  10. Passe lentamente o laço inoculante através da parte mais quente da chama (ponta do cone azul). O laço deve ficar vermelho quente para fins de esterilização.

2. Transferências Bacterianas: Da Placa de Petri para a Placa de Petri

  1. Um cenário de transferência de bactérias é de uma placa de Petri que mostra o crescimento de um isolado cultivado para outra placa Petri estéril contendo um meio de crescimento à base de ágar.
  2. Para começar, abra ligeiramente a placa de Petri contendo a cultura bacteriana pura, e bata suavemente o laço inoculante quente e esterilizado na superfície do ágar.
  3. Recupere uma colônia isolada da superfície da placa usando o laço inoculante resfriado e feche a placa de Petri.
  4. Execute uma raia para isolamento usando uma placa petri fresca contendo meio de cultura, com a tampa ligeiramente entreaberta.
  5. Para cada porção da raia de isolamento (3 total por placa), esterilizar a alça inoculante pouco antes de ser usada. Além disso, a chama esteriliza o laço logo após a raia final é realizada a fim de evitar a contaminação da superfície do banco e como uma consideração para outros no laboratório que podem mais tarde usar ou entrar em contato com os laços inoculadores.
  6. Coloque as placas listradas em uma incubadora para crescimento durante a noite.

3. Transferências Bacterianas: Da Cultura do Caldo à Placa de Petri

  1. Um segundo cenário de transferência de bactérias é de uma cultura de caldo que apresenta crescimento, como geralmente observado pela turbidez, para uma placa de Petri estéril contendo meio de crescimento.
  2. Remova a tampa do tubo de ensaio (ou frasco) contendo a cultura bacteriana pura e passe a abertura do recipiente 2-3x através da porção mais quente da chama. Para evitar contaminação, não coloque a tampa no banco.
  3. Abaixe cuidadosamente a alça de inoculação esterilizada no tubo/frasco e pressione suavemente contra a lateral do recipiente para esfriar antes de inserir na cultura do caldo.
  4. Remova um loopful de cultura de caldo(Figura 5),e substitua imediatamente a tampa.
    Figure 5
    Figura 5: Um loopful de cultura de caldo.
  5. Execute uma raia para isolamento usando uma placa petri fresca contendo meio de cultura, com a tampa ligeiramente entreaberta.
  6. Para cada porção da raia (3 total por placa), esterilizar a alça inoculante pouco antes de ser usada. Além disso, a chama esteriliza o laço logo após a raia final é realizada a fim de evitar a contaminação da superfície do banco e como uma consideração para outros no laboratório que podem mais tarde usar os laços inoculadores.
  7. Coloque as placas listradas para isolamento em uma incubadora para crescimento durante a noite.

4. Transferências Bacterianas: Da placa de Petri com crescimento para meio líquido estéril

  1. Um terceiro cenário de transferência de bactérias é de uma placa de Petri contendo uma raia de cultura isolada para um tubo/frasco contendo meio de crescimento líquido estéril.
  2. Abra ligeiramente a placa de Petri contendo a cultura bacteriana pura, e esfrie o laço inoculante quente batendo-o suavemente na superfície do ágar.
  3. Recupere uma colônia isolada da superfície da placa usando o laço inoculante resfriado e feche a placa de Petri.
  4. Remova a tampa do tubo de ensaio (ou frasco) contendo o meio de crescimento líquido estéril e passe a abertura do recipiente 2 a 3 vezes através da porção mais quente da chama. Para evitar contaminação, não coloque a tampa nobanco.
  5. Abaixe cuidadosamente a colônia extraída no meio do caldo líquido e agitar suavemente o laço para liberar as bactérias. Substitua imediatamente a tampa.
  6. Esterilizar a alça inoculante para evitar a contaminação da superfície do banco e como uma consideração para outros no laboratório que podem mais tarde usar os laços inoculadores.
  7. Coloque o frasco em uma incubadora para crescer durante a noite.
  8. Remova o frasco da incubação no dia seguinte. Realizar uma série de diluição para enumerar a cultura.
  9. Emplaque as diluições da série para a mídia cultural agarose, e incubar as placas durante a noite.
  10. Remova as placas no dia seguinte e observe se há alguma contaminação.

5. Transferências Bacterianas: Da Cultura do Caldo ao Meio de Crescimento Líquido Estéril

  1. Um quarto cenário de transferência de bactérias é de uma cultura de caldo que exibe crescimento para um tubo/frasco contendo meio de crescimento líquido estéril.
  2. Remova a tampa do tubo de ensaio (ou frasco) contendo a cultura bacteriana pura e passe a abertura do recipiente duas vezes através da porção mais quente da chama. Para evitar contaminação, não coloque a tampa no banco.
  3. Abaixe cuidadosamente a alça de inoculação no tubo/frasco e pressione suavemente contra a lateral do recipiente para esfriar antes de inserir na cultura do caldo.
  4. Remova um loopful de cultura de caldo e substitua imediatamente a tampa.
  5. Remova a tampa do tubo de ensaio (ou frasco) contendo o meio de crescimento líquido estéril e passe a abertura do recipiente duas vezes através da porção mais quente da chama. Para evitar contaminação, não coloque a tampa no banco.
  6. Abaixe cuidadosamente o loopful extraído no meio de caldo líquido estéril e agitar suavemente o laço para liberar as bactérias. Substitua imediatamente a tampa.
  7. Esterilizar a alça inoculante(Figura 6)para evitar a contaminação da superfície do banco e como uma consideração para outros no laboratório que podem mais tarde usar os laços inoculadores.
    Figure 6
    Figura 6: Loop inoculante ficando vermelho quente enquanto é esterilizado com um queimador Bunsen.
  8. Coloque o frasco em uma incubadora para crescer durante a noite.
  9. Remova o frasco da incubação no dia seguinte. Realizar uma série de diluição para enumerar a cultura.
  10. Emplaque as diluições da série para a mídia cultural agarose, e incubar as placas durante a noite.
  11. Remova as placas no dia seguinte e observe se há alguma contaminação.

A técnica asséptica é uma habilidade fundamental em microbiologia, e tem aplicações cruciais em pesquisa ambiental.

Se as culturas microbiológicas estiverem contaminadas, o tempo, o trabalho e os custos financeiros que seriam exigidos de um laboratório para "limpar" ou substituir as culturas, particularmente isolados raros de ambientes únicos, podem ser muito altos e proibitivos, e algumas amostras podem ser insubstituíveis.

O uso adequado de técnicas assépticas reduz a probabilidade de contaminação bacteriana e fúngica de reagentes, meios culturais e amostras ambientais, e também evita a contaminação cruzada entre amostras. É também uma medida de segurança que diminui a transmissão potencial de micróbios para o experimentador, o que é especialmente importante quando se trabalha com patógenos.

Este vídeo introduzirá os princípios da assepsia; várias técnicas importantes para manter reagentes e culturas estéreis; e, finalmente, alguns de seus usos na ciência ambiental.

O objetivo do uso de técnicas assépticas é criar e manter um ambiente de trabalho estéril, equipamentos e reagentes, de modo a minimizar a contaminação de amostras biológicas. As fontes comuns de contaminação incluem microrganismos aéreos, micróbios presentes no banco de laboratório ou equipamentos, e os do cabelo, corpo e roupas do pesquisador.

Dois tipos de agentes são centrais para remover ou prevenir contaminação em laboratório: produtos químicos desinfetantes e calor. Soluções como 70% de etanol e alvejante diluído são frequentemente usadas para desinfetar equipamentos, superfícies de trabalho e luvas de experimentadores antes de se envolver em trabalho asséptico.

Ao mesmo tempo, micróbios sobre ou em ferramentas, vidros e mídia líquida podem ser mortos no calor em uma autoclave, que é uma câmara que esteriliza o conteúdo através da exposição ao vapor pressurizado de alta temperatura. Além disso, ferramentas como barras de vidro usadas para revestimentos espalhados e laços de inoculação metálica podem ser esterilizadas pelo calor usando uma fonte de chama, como um queimador bunsen.

O uso de uma fonte de chama também é uma das formas mais comuns de estabelecer um ambiente de trabalho asséptico. O calor da chama causa convecção de ar, gerando uma corrente ascendente que eleva qualquer contaminante aéreo para longe das proximidades do queimador, e criando um "campo estéril" para realizar um trabalho experimental asséptico.

Agora que você entende os princípios por trás das técnicas assépticas e por que elas são importantes, vamos passar por um protocolo para criar um ambiente de trabalho asséptico, compõem a mídia de crescimento estéril e a transferência asepticamente de bactérias entre diferentes condições de cultivo.

Antes de iniciar o trabalho asséptico, é importante que o experimentador dou equipamentos de proteção individual adequados, ou EPI. O objetivo disso é tanto evitar que o experimentador contamine as amostras e culturas de laboratório, quanto também impedir a transferência de micróbios potencialmente patogênicos para o pesquisador. Os itens de EPI incluem um jaleco, luvas e óculos de segurança.

O próximo passo é esterilizar e armazenar adequadamente as mídias de crescimento a serem usadas para a cultura das amostras microbianas. Primeiro, pese a quantidade adequada de componentes médios sólidos e adicione-os ao volume adequado de solvente líquido especificado pelo fabricante, como água deionizada, em um recipiente autoclavável Adicione uma barra de agitação magnética, coloque o recipiente em um agitador de placa quente e dissolva os componentes médios sólidos com fogo baixo e agitação.

Feche os recipientes médios. Se usar um vaso de vidro com tampa de parafuso, certifique-se de não apertar completamente a tampa, pois o ar dentro dos vasos se expandirá devido ao aquecimento durante a autoclavagem e precisa escapar. Sem fuga, o gás pode causar a ruptura da nave. Coloque um pedaço de fita autoclave nos vasos e autoclave a mídia de acordo com as instruções do fabricante, como 20 min a 121 °C. Após autoclavação, verifique se as listras das fitas autoclave ficaram pretas, indicando que a temperatura adequada foi atingida.

Para a mídia de crescimento líquido, deixe-os esfriar à temperatura ambiente, e armazená-los à temperatura ambiente ou com refrigeração conforme apropriado. Para uma mídia de crescimento sólido à base de ágar, deixe esfriar a aproximadamente 50 °C, em seguida, despeje em pratos petri estéreis. Deixe o ágar esfriar e solidificar antes de armazenar na temperatura apropriada.

Para mídias que não podem ser autoclavadas devido à presença de componentes sensíveis ao calor, o filtro esteriliza usando um filtro de 0,22-μm.

Uma técnica central no trabalho microbiológico é transferir asticamente culturas bacterianas entre diferentes mídias de crescimento, sólidas e líquidas. Antes de começar, limpe a superfície do banco do laboratório com um desinfetante. Isso reduz o risco de contaminar culturas ou mídia estéril.

A transferência de culturas bacterianas geralmente faz uso de uma ferramenta chamada loop inoculante, que precisa ser esterilizada antes de ser usada pelo aquecimento em uma chama.

Ligue uma fonte de chama. Passe lentamente o laço inoculante através da ponta da chama. O laço vai ficar vermelho quente. Para transferir uma colônia bacteriana de uma placa de ágar sólida, abra ligeiramente a placa de Petri, e bata suavemente o laço inoculante quente em uma parte vazia da superfície do ágar para evitar que o calor mate as bactérias. Raspe uma única colônia com o laço inoculante, e feche a placa.

Para transferir bactérias de um meio de crescimento líquido, remova a tampa do recipiente de cultura. Para ajudar a evitar contaminação, evite colocar a tampa no banco. Passe a boca do recipiente 2-3 vezes através da porção mais quente da chama. Em seguida, toque cuidadosamente o laço de inoculação quente e esterilizado no interior do recipiente e deixe esfriar antes de inseri-lo na cultura do caldo. Remova um loopful da cultura e feche imediatamente a tampa.

Para transferir as bactérias obtidas para um meio de crescimento estéril, remova a tampa de um recipiente com o caldo estéril e passe a abertura do recipiente através da chama 2-3 vezes. Em seguida, abaixe cuidadosamente a alça de inoculação para o meio e agitar suavemente para liberar as bactérias. Feche imediatamente a tampa. Esterilize o laço de inoculação após o uso.

Se transferir bactérias para uma placa de ágar estéril, abra a tampa de uma placa de Petri fresca com ágar não vacinado. Traço o laço de inoculação com a cultura bacteriana vai e volta em um setor do ágar. Esterilize o laço e esfrie-o tocando uma parte vazia do ágar, em seguida, faça outra raia no ágar em um ângulo obtuso para a primeira raia, certificando-se de cruzar a primeira raia nos primeiros 1-2 golpes, mas evite tocar a primeira raia em traçados subsequentes. Repita a esterilização e a estria mais 2 vezes. Feche a placa de Petri e esterilize a alça de inoculação.

Uma vez inoculado, o caldo ou placa de ágar deve então ser incubado na temperatura ideal de crescimento para o microrganismo dado para obter cultura viável. Em meio sólido, um gramado ou um fio contínuo de bactérias seriam visíveis no ágar coberto pelas duas primeiras raias, mas colônias individuais devem ser obtidas na raia final. Técnicas assépticas ruins resultariam no crescimento de mofo e outros contaminantes na placa.

Técnicas assépticas são importantes em muitos experimentos envolvendo amostras microbianas do ambiente. Neste estudo, os pesquisadores isolaram bacteriófagos, que são vírus infectantes de bactérias, da bactéria do solo comum Arthrobacter. As culturas de arthrobacter foram cultivadas pela primeira vez em condições assépticas. As amostras do solo foram então lavadas e filtradas em tampão de phage, e a solução de phage foi misturada com a cultura bacteriana e banhada em placas de ágar. Um gramado bacteriano se formaria na placa, mas haveria clareiras, ou "placas", em locais onde o vírus infectou e matou as bactérias. Phage poderia então ser purificado a partir dessas placas para estudos mais aprofundados.

Além do uso de queimadores Bunsen, ambientes de trabalho assépticos também podem ser mantidos em estações de trabalho especializadas conhecidas como capas de fluxo laminar, que usam fluxo de ar direcionado e filtros para manter a esterilidade. Aqui, os cientistas trabalharam em uma capa de fluxo para isolar bactérias patogênicas potenciais e vírus de amostras de água. Esses isolados foram então cultivados junto com amebas. Como a amebas normalmente come ou "fagocitose" bactérias, qualquer bactéria que tenha sido capaz de resistir à digestão amebal e permanecer nesses organismos também pode permanecer viável nas células humanas e causar doenças.

Finalmente, condições estéreis permitem um estudo detalhado de mecanismos ecológicos, como a formação de nódulos radiculares em plantas leguminosas - órgãos cheios de bactérias que "fixam" nitrogênio atmosférico em amônia, que é usado pela planta para o crescimento. Os pesquisadores criaram "microcosmos" para estudar o processo de nodulação usando placas de Petri entalhadas com meio de crescimento vegetal, colocaram mudas nelas e inocularam as mudas com bactérias rizobiais formadoras de nódulos. O ambiente asséptico da coifa evita a contaminação das culturas com outras bactérias ou fungos.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre técnicas assépticas em ciência ambiental. Você deve agora entender por que as condições de trabalho assépticas são importantes; como realizar os experimentos microbiológicos assepticamente; e algumas aplicações de técnicas assépticas à pesquisa ambiental. Como sempre, obrigado por assistir!

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Results

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O resultado do procedimento demonstra técnica asséptica adequada e má técnica asséptica. A Figura 7 ilustra a contaminação que pode surgir da má técnica asséptica ao derramar placas de agarose (placa superior: meio estéril; placas inferiores: mídia contaminada).

Figure 7
Figura 7: Contaminação que pode surgir da má técnica asséptica ao derramar placas de ágarose. Placa superior: meio estéril; placas inferiores: mídia contaminada.

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Applications and Summary

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Além do uso de queimadores Bunsen, ambientes de trabalho assépticos também podem ser mantidos em estações de trabalho especializadas conhecidas como capas de fluxo laminar, que usam fluxo de ar direcionado e filtros para manter a esterilidade.

O uso adequado da técnica asséptica é vital para microbiologistas ambientais na amostragem no campo e no laboratório quando se trabalha com mídia, reagentes e isolados cultivados.  A má técnica asséptica no campo pode resultar na transferência de microrganismos do técnico para amostras ambientais críticas, bem como na contaminação cruzada de micróbios de uma amostra para outra. Tais eventos são importantes, por exemplo, em estudos de ecologia microbiana que buscam identificar e comparar populações bacterianas e fúngicas que possam estar presentes em um determinado bioma. A contaminação dessas amostras pode resultar em perda de integridade dos dados. A técnica asséptica também é fundamental para a manutenção de isolados de cultura laboratorial originários da amostragem de campo ou de repositórios de cultura microbiana e celular bem estabelecidos. Os custos de tempo, trabalho e financeiro que seriam exigidos de um laboratório em um esforço para "limpar" ou substituir culturas contaminadas, particularmente isolados raros de ambientes únicos, poderiam ser muito altos e proibitivos, pois alguns isolados podem ser insubstituíveis.

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