Overview
מקור: מעבדות של מרגרט וורקמן וקימברלי פריי - אוניברסיטת דפול
שינוי גנטי של מזונות היה נושא שנוי במחלוקת בשל חששות שנויים במחלוקת על בריאות ובטיחות הסביבה. ניסוי זה מדגים הבנה טכנית של האופן שבו DNA מזון מזוהה גנטית, ומאפשר קבלת החלטות משכילה על הבטיחות ואת הסכנות הפוטנציאליות של שימוש אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMOs) באספקת מזון.
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) משמשת להגברת DNA מזון כדי לבדוק את נוכחותו של DNA מהונדס גנטית במוצרי מזון. נוכחות של רצועות DNA ספציפיות מזוהה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל למשוך DNA מזון שחולץ דרך ג'ל אגרוז 3%, ריכוז צפוף מספיק כדי להפריד את רצועות ה- DNA המכיל את ה- DNA מהונדס גנטית. מספר פקדים משמשים בהליך אלקטרופורזה כדי להבטיח שהדנ"א מופק בהצלחה ממזונות בדיקה (פריימר צמחי), ולספק דוגמאות ידועות הן לדנ"א מהונדס גנטית (שנרכש בדנ"א מהונדס גנטית) והן לדנ"א שאינו מהונדס גנטית (בקרת מזון מאושרת שאינה מהונדסת גנטית).
Principles
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מזהה רצפים של DNA שהוכנסו לצמח GM. בניגוד לחלבונים, DNA הוא מולקולה יציבה יחסית, ולכן שברי DNA יכולים להיות מבודדים מסחורות מעובדות מאוד והם שלמים מספיק כדי להיות מוגבר על ידי PCR. מהנדסים גנטיים משתמשים רק במספר קטן של רצפי רגולציה (רצפי מקדם ומחסל) כדי לשלוט בביטוי הגנים המוחדרים, ולכן רצפים אלה משותפים לרוב גידולי GM. שני הרצפים שזוהו בהליך זה הם שניים מהרצפים הרגולטוריים הנפוצים ביותר, גן מקדם 35S מווירוס פסיפס כרובית (CaMV) וגין המחסל nopaline synthase (NOS) מ- Agrobacterium tumefaciens.
PCR כרוך במחזורים חוזרים ונשנים, כל אחד מורכב denaturation תבנית, חישול פריימר, והרחבה של פריימר מחושה על ידי פולימראז DNA טאק. לאחר ש- DNA מופק ממזון, רוכב אופניים תרמי משמש לתפעול מהיר של הטמפרטורה, מה שגורם לשלבים של מחזורי ה- PCR.
שלב denaturing מתרחשת כאשר דגימות מחוממות במהירות ל 94 °C (70 °F), גרימת גדילי ה- DNA להיפרד. קירור מהיר ל-59 מעלות צלזיוס מאפשר פריימרים לחנן את גדילי הדנ"א המופרדים, ואז לחמם מחדש ל-72 מעלות צלזיוס כדי להאריך את הפריימרים, ליצור עותקים מלאים של כל גדיל דנ"א ולהשלים מחזור תרמי אחד.
לאחר מכן ניתן להפעיל את הדנ"א המוגבר באמצעות ג'ל אגרוז עם אלקטרופורזה כדי להפריד את הדנ"א לרצועות גלויות לזיהוי הגן מקדם 35S ומחסל NOS. DNA מוגבר נטען לבארות בקצה אחד של הג'ל, באמצעות צבע טעינה שנרכש המסייע להכביד על הדגימה כדי למנוע פירוק לתוך המאגר שמסביב. צבע הטעינה מספק גם חזותי, כך שניתן לראות את תנועת ה- DNA במהלך אלקטרופורזה בצבע "מלפנים". תהליך האלקטרופורזה פועל באמצעות זרם חשמלי המופרד לקתודה וקצוות אנודה. DNA נטען לתוך הג'ל בקצה הקרוב ביותר לצד הקתודה של התא, ואת המטען השלילי של DNA נמשך לקצה האנודה של התא והוא נמשך דרך agarose. רצפים גדולים יותר של DNA (מספר גדל של זוגות בסיס) אינם יכולים לנוע באותה קלות דרך אגרוז ויפרדו מוקדם, בעוד הרצפים הקטנים יותר מסוגלים לנוע רחוק יותר במורד הג'ל לכיוון סוף האנודה.
תהליך הכתמה מסייע על ידי קשירה ל- DNA על מנת להוסיף ניגוד בין ג'ל הרקע לבין בנקי ה- DNA להדמיה טובה יותר של התוצאות. באמצעות מיקומים ידועים שסופקו בגדלים שונים של רצפי DNA ניתן לנתח כל ג'ל בדיקה עבור נוכחות או היעדר של גנים מקדם 35S ו- NOS שליחות קטלנית.
בקרות משמשות כדי להבטיח DNA מופק כראוי כדי לספק השוואה דגימות מזון הבדיקה. פריימר צמח שנרכש מתווסף לכל מדגם כדי לספק חומצות גרעין המשותפות לכל הצמחים. זה מאפשר בדיקת בקרת איכות על תהליך מיצוי ה- DNA, כי כל DNA צמח שחולץ צריך להיות מורחב עם פריימר זה במהלך PCR ויש לראות גם על הג'ל לאחר אלקטרופורזה הושלמה. פריימר שנרכש עבור הגנים 35S ו- NOS משמשים כשליטה חיובית כדי לספק רצועות DNA על הג'ל לשינוי גנטי. אם בקרת התבנית החיובית ל- GMO אינה מגבירה, קיימת בעיה בתגובת ה- PCR ולא ניתן לסמוך על תוצאה שלילית של GMO ממזון הבדיקה. מוצר מזון מאושר שאינו מהונדס גנטית נרכש גם הוא ומשמש כשליטה שלילית כדי להראות איך נראית הפרדת דנ"א כאשר לא קיים חומר מהונדס גנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הפקת דנ"א מדגימות מזון
- הוסף 500 μL של מטריצת תערובת PCR שנרכשה לכל אחד מ-2 צינורות מכסה הברגים באמצעות צינור העברה או 200-1,000 מיקרופיפט בנפח מתכוונן של 200-1,000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עם הצינור בין כל aliquot לערבב באופן שווה את מטריצת PCR.
- תייג צינור בורג אחד "ללא רכיבים מהונדסים גנטית" והשני "בדיקה".
- יש לשקול 0.5 גרם של מזון מוסמך ללא רכיבים מהונדסים גנטית ולשים אותו במרגמה.
- מוסיפים 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וטוחנים עם עלה במשך 2 דקות כדי ליצור רפש.
- מוסיפים עוד 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וממשיכים לטחון עם עלה עד שההתרפסות הופכת לחלקה מספיק כדי להזרים.
- Pipet 50 μL של תרחיף הקרקע לצינור בורג-cap המכיל 500 μL של PREMIX PCR שכותרתו "ללא מהונדס גנטית" באמצעות סימן 50-μL על צינור מדורג. צינור סיכום.
- חזור על שלבים 1.3-1.6 כדי להכין את דגימת המזון לבדיקה.
- Pipet 50 μL של מזון מבחן הקרקע slurry לצינור בורג-cap שכותרתו "מבחן". צינור סיכום.
- מערבולת מזון ללא GMO וצינורות PCR מזון מבחן במשך 1 דקות ומניחים צינורות באמבט מים 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אם אין מערבולת זמינה, להקפל את הצינור מספר פעמים לערבב לפני הצבה באמבט מים.
- מניחים צינורות בצנטריפוגה למשך 5 דקות. גלולה מוצקה צריכה להיווצר בתחתית הצינור. אם הכדור אינו נוצר לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב במשך 2 דקות מרווחים עד שנוצר גלולה.
- צינורות יכולים לשמש באופן מיידי עבור PCR או מאוחסנים במקרר עד שבוע אחד.
2. הגדרת תגובות PCR
- מספר צינורות PCR 1-6 וראשי תיבות אותם. המספרים אמורים להתאים לתוכן הצינור הבא המפורט בטבלה 1.
- מניחים כל צינור PCR מסומן במחזיק microTube עם כובעים פתוחים.
- באמצעות עצה חדשה עבור כל תוספת, להוסיף 20 μL של פריימר המצוין על טבלה 1 לכל צינור PCR. צינורות כובע.
- באמצעות קצה טרי עבור כל צינור, להוסיף 20 μL של דגימת ה- DNA המצוין על שולחן 1 לכל צינור PCR, להיות בטוח pipette רק מן supernatant והימנעות גלולה מוצק בתחתית הצינורות.
- לאחר כל דגימת DNA הוא pipetted לתוך צינור PCR המתאים, להשתמש pipette לערבב DNA פריימר על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה; סיכום צינורות.
- מקם צינורות PCR ב אופניים תרמי ולתכנת את רוכב האופניים עבור:
דנטורה ראשונית: מחזור אחד ב 94 °C (70 °F) במשך 2 דקות.
הגברה: 40 מחזורים ב 94 °C (74 °F) במשך 1 דקות (denature), 59 °C (חישול), ו 72 °C (72 °F) במשך 2 דקות (הארכה).
הארכה סופית: מחזור אחד ב 72 °C (72 °F) במשך 10 דקות.
החזקה: 4 °C ללא הגבלת זמן.
3. 3% הכנת ג'ל אגרוז
- באמצעות מעבדה או סרט מיסוך, יש להדביק בבטחה את הקצוות הפתוחים של מגש הג'ל. ודא שהקלטת אטומה בשולי המגש כדי למנוע אגרוז מותך לדלוף החוצה.
- לשקול 3 גרם של agarose לתוך בקבוקון 250 מ"ל או גדול יותר ארלנמאייר.
- הוסף 100 מ"ל של מאגר 1x TAE (נרכש או מוכן מהתרכיז).
- בעזרת צלחת חמה מגנטית עם מוט ערבוב, מחממים את הכוס עד שאגורז מומס לחלוטין במאגר והפתרון רותח ומתבהר. לחלופין, מיקרוגל יכול לשמש על ידי הצבת בתנור וחימום במשך 30 מרווחים, באמצעות מוט ערבוב לערבב כל 10 שניות, חוזר עד התערובת רותחת ומתבהר.
- הפוך בקבוק ארלנמאייר 50 מ"ל לתוך הפתיחה של בקבוקון 250 מ"ל לשמש ריפלוקס, מניעת פתרון אגרוז מתאדה.
- אפשר פתרון אגרוז להתקרר עד 60 °C (60 °F), ויוצקים 30-50 מ"ל לתוך כל מגש ג'ל מודבק.
- מניחים מסרק ג'ל לתוך זוג החיצנים הראשונים כדי ליצור בארות ג'ל.
- אפשר ג'ל להתקרר לחלוטין לפני הסרת סרט הדבקה ומסרק. הג'ל יתמצק ויהפוך בהיר לענן כאשר הוא מוכן, כ-10-20 דקות.
4. אלקטרופורזה של מוצרי PCR
- מניחים ג'ל אגרוז 3% עשוי מראש על מגש ג'ל או משתמשים במגש ג'ל ששימש ליציקת ג'ל אגרוז 3% שנשפך.
- החלק מגש ג'ל לתוך תא האלקטרופורזה עם בארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה (שחור).
- יוצקים 1x חיץ TAE לתוך התא, מספיק כדי לקבל 2 מ"מ של חוצץ מעל החלק העליון של מגש הג'ל.
- להשיג צינורות PCR מן רוכב האופניים התרמי ומניחים מחזיק microTube.
- באמצעות טיפ פיפטה טרי בכל פעם, להוסיף 10 μL של צבע טעינה תפוז G שנרכש (LD) לכל מדגם ומערבבים היטב.
- טען 20 μl של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל בסדר המצוין (טבלה 2).
- הפעל אלקטרופורזה ג'ל במשך 30 דקות ב 100 V.
- הסר מגש ג'ל מהתא וג'ל שקופית כדי להסיר מהמגש. מניחים ג'ל במגש כתמים.
- יש לטבול ג'ל בכתם ג'ל DNA שנרכש במשך 5 דקות, ולנער בזהירות את המגש כדי לעזור להפיץ את הכתם לאורך הג'ל.
- מעבירים את הג'ל למיכל כביסה ושוטפים במי ברז (40-55 מעלות צלזיוס) למשך כ-10 מעלות.
- יש להקנות על ידי שטיפת 3x במי ברז חמים למשך 6 דקות כל אחד עם רעידות עדינות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, יש להמשיך להתיר במים חמים עד להגעה לניגוד הרצוי.
| מספר צינור | תחל | דגימת דנ"א |
| 1 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 2 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 3 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 4 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 5 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
| 6 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
טבלה 1. רשימה של מספרי הצינור המתאימים, פריימרים, ודגימות DNA.
| ובכן 1 | מדגם 1 בקרת מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 2 | דגימה 2 בקרת מזון ללא מהונדס גנטית עם פריימרים מהונדסים גנטית 20 μL. |
| ובכן 3 | מדגם 3 מזון בדיקה עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 4 | מדגם 4 מזון בדיקה עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 5 | דגימת 5 GMO DNA חיובי עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 6 | דגימת 6 GMO DNA חיובי עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 7 | סרגל משקל מולקולרי PCR 20 μL. |
| ובכן 8 | תשאירו ריקים. |
טבלה 2. הסדר המתאים לטעון 20 μL של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל.
מזונות מהונדסים גנטית הם מוצרים המכילים מרכיב או מרכיבים שהדנ"א שלהם השתנה במיוחד. נוכחות של שינויים אלה ניתן לזהות באמצעות טכניקה הנקראת תגובת שרשרת פולימראז.
שינוי גנטי של מזונות היה נושא שנוי במחלוקת בשל חששות שנויים במחלוקת על בריאות ובטיחות הסביבה. היכולת לזהות דנ"א שהשתנה גנטית בדגימות מזון של עניין מאפשרת קבלת החלטות מושכלת לגבי הבטיחות והסכנות הפוטנציאליות של שימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית, או GMO של, באספקת מזון.
תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, משמשת להגברת DNA מזון כדי לקבוע את נוכחותם או היעדר רצפים מהונדסים גנטית. אלקטרופורזה ג'ל לאחר מכן מושך את ה- DNA המוגבר דרך מטריצת ג'ל אגרוז ומפריד רצועות DNA בגדלים שונים התואמים סמנים שונה או לא שונה. אלה משווים לאחר מכן להקות בקרה ממזונות הידועים כמכילים GMO של, או ידוע להיות שינוי חינם.
סרטון זה ימחיש את העקרונות העומדים מאחורי גילוי דנ"א מהונדס גנטית מדגימות מזון, כיצד לחלץ דנ"א ולהגביר סמנים המשמשים בתהליך השינוי הגנטי, וכיצד ניתן לקבוע נוכחות או היעדר של GMO בדגימות מזון.
תגובת שרשרת פולימראז מזהה רצפים של דנ"א שהוכנסו למזון מהונדס גנטית. DNA הוא מולקולה יציבה יחסית, ולכן שברי DNA קיימא המתאימים להגברה יכולים להיות מבודדים אפילו מסחורות מעובדות מאוד, כמו שבבי תירס או המבורגרים צמחיים.
מספר קטן של רצפי דנ"א רגולטוריים משמשים לשליטה בביטוי של גנים שהוכנסו, כך שרצפים אלה נמצאים ברוב גידולי GM. הליך זה מזהה שניים מן הנפוצים ביותר בשימוש, הגן מקדם 35S ואת הגן מסינתאז nopaline שליחות קטלנית. רצף 35S הוא מקדם חזק, וכאשר מצורף לגן מוכנס יניע קבוע, רמות גבוהות של ביטוי. המחסל הסינתאז nopaline כלול כדי לעצור את שעתוק הגן המוחדר בנקודת הקצה הרצויה.
PCR כרוך במחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים ברכיב אופניים תרמי, מכונה השולטת בחוזקה בטמפרטורה של צינורות התגובה PCR. חימום הדגימה ל 94 °C (70 °F) גורם גדילי DNA denature ולהפריד. קירור מהיר ל-45 עד 65 מעלות צלזיוס מאפשר פריימרים לתליתי הדנ"א המופרדים. לבסוף, התחממות ל 72 מעלות צלזיוס מאפשרת אנזים פולימראז טאק להרחיב את פריימרים ושכפול מלא של אזור היעד.
פריימר צמחי שנרכש מתווסף לכל דגימה, ויגביר בדגימות המכילות DNA של צמחים. תבניות חיוביות של GMO עבור 35S ו- NOS משמשות כדי לספק בקרה חיובית עבור מיקומים מהונדסים גנטית. רכיב ללא רכיבים מהונדסים גנטית מוסמך משמש כשליטה שלילית. אם אחת מתגובות בקרה אלה מציגה רצועות בלתי צפויות, לא ניתן לסמוך על התוצאות של דגימות בדיקה.
דנ"א מוגבר עובר דרך ג'ל אגרוז על ידי אלקטרופורזה. מוצרי PCR מעורבבים עם צבע ונטענים לבארות. DNA טעון שלילית, וכאשר נטען לתוך הג'ל בקצה הקתודה של התא יעבור לכיוון סוף אנודה כאשר הזרם מוחל. שברי דנ"א גדולים יותר אינם יכולים לנוע באותה קלות דרך מטריצת הג'ל ולכן יישארו קרובים יותר לקתודה, בעוד רצפים קטנים יותר נעים לכיוון קצה האנודה, וכתוצאה מכך הפרדת דנ"א בגודל שונה ללהקות נפרדות.
לאחר אלקטרופורזה, כתמי ג'ל מסייעים לדמיין רצועות DNA מופרדות.
כעת, כאשר אנו מכירים את העקרונות העומדים מאחורי זיהוי GMO ושימוש ב- PCR ואלקטרופורזה לזיהוי GMO, בואו נבחן כיצד ניתן לבצע זאת במעבדה.
לאחר שמוצרי המזון מעניינים זוהו, הניתוח יכול להתחיל. כדי לחלץ את ה- DNA, לקחת שני צינורות בורג נקיים, לתוך כל אלה העברה 500 μL של ריאגנט בידוד DNA שנרכש, הקפדה pipette את התערובת למעלה ולמטה בין aliquots לערבב באופן שווה את ריאגנט. תייג את אחד הצינורות "ללא -GMO", והשני "בדיקה".
לאחר מכן, לשקול 0.5 גרם של מזון מוסמך שאינו מהונדס גנטית, ולהניח לתוך מרגמה נקייה. מוסיפים 2.5 מ"ל של מים מזוקקים, וטוחנים עם עלה במשך 2 דקות כדי ליצור רפש. מוסיפים עוד 2.5 מ"ל מים מזוקקים וממשיכים לטחון את העכוס עד שהוא הופך להיות חלק מספיק כדי pipette.
Pipette 50 μL של התסיסה הידועה שאינה מהונדסת גנטית לצינור בורגק "שאינו מהונדס גנטית" שכותרתו המכילה את ריאגנט בידוד ה- DNA. עכשיו להוסיף 50 μL של מזון הבדיקה מזון slurry לצינור בורגק מסומן "מבחן". מערבולת שתי הצינורות המכילים את דגימות המזון ואת ריאגנט DNA במשך 1 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות באמבט מים ב 95 °C (5 דקות). לבסוף, מניחים את הצינורות בצנטריפוגה במשך 5 דקות. לאחר הבדיקה, כדור מוצק צריך להיווצר בתחתית הצינור. אם כדור לא נוצר לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב עבור מרווחים של 2 דקות עד גלולה נוצרת. כעת ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי עבור PCR, או לאחסן במקרר עד שבוע.
ראשית, מספר שש צינורות פי.סי.אר. מספרים אלה יתאימו לתוכן הצינור המפורט בטבלה. מניחים כל אחד מצינורות ה- PCR המסומנים במחזיק microTube עם כובעים פתוחים.
באמצעות עצה חדשה עבור כל תוספת, הוסף פריימר 20 μL המצוין בטבלה לכל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף 20 μL של דגימות DNA המצוין בטבלה לכל צינור PCR. פיפטה למעלה ולמטה לערבב. עבור דגימות כדוריות, הקפד pipette רק מן supernatant, ולהימנע גלולה מוצק בתחתית הצינורות. לבסוף, מניחים את צינורות ה- PCR לתוך רוכב אופניים תרמי ולתכנת אותו מחזור דרך שלבי חימום וקירור המצוין בטבלה.
מניחים ג'ל אגרוז 3% לתוך תא האלקטרופורזה עם בארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה. מוסיפים את מאגר TAE לתא כדי לכסות 2 מ"מ מעל מגש הג'ל. לאסוף את צינורות PCR מן thermocycler ומניחים אותם במחזיק microTube. בעזרת טיפ פיפטה טרי בכל פעם, הוסיפו 10 מיקרו-אל של צבע טעינת DNA שנרכש לכל דגימה וערבבו היטב.
באמצעות טיפ טרי בכל פעם, לטעון את הבארות של ג'ל אגרוז עם 20 μL של סרגל משקל מולקולרי לתוך באר אחת, ו 20 μL של כל דגימה לתוך הבארות הבאות, כפי שצוין בטבלה זו. הגדר את תא אלקטרופורזה לרוץ ב 100 V במשך 30 דקות.
לאחר שהג'ל סיים לרוץ, נתק בזהירות את תא הג'ל, הסר את המגש והחלק את הג'ל למגש כתמים. לטבול את הג'ל בכתם ג'ל 100x שנרכש במשך 5 דקות מנער את המגש בעדינות כדי להפיץ את הכתם. לאחר הכתם, מעבירים את הג'ל למיכל כביסה ושוטפים במי ברז כ-10 מטרים. יש להקנות את ההסתה על ידי שטיפת שלוש פעמים במי ברז חמים למשך 3 דקות כל אחת, כל אחת עם ניעור עדין לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, יש להמשיך להתיר במים חמים עד להגעה לניגוד הרצוי.
נוכחות או היעדר של רצועת 200 bp בנתיב 4 מציינת אם מזון הבדיקה מכיל הורים מהונדסים הורים מהונדסים ותומיים. פריימרים הצמח לקבוע אם DNA הצמח הופק בהצלחה מן המדגם. בקרת המזון ללא GMO היא אינדיקטור לתוצאות חיוביות שגויות, אם הן מתרחשות. אם בקרת המזון שאינה מהונדסת גנטית יוצאת חיובית, זה אומר PCR היה מזוהם בשלב מסוים. פקד התבנית החיובית ל- GMO הוא אינדיקטור לתשלילים כוזבים. אם בקרת התבנית החיובית ל- GMO אינה מגבירה, קיימת בעיה בתגובת ה- PCR ולא ניתן לסמוך על תוצאה שלילית של GMO ממזון הבדיקה.
ניתן להניח ג'לים על נייר לבן או צהוב כדי לספק רקע מנוגד כדי להדגיש רצועות DNA, או ניגודיות מוגברת ניתן להשיג באמצעות תיבת אור UV.
היכולת לבדוק מצרכי מזון או מוצרים עבור מרכיבים מהונדסים גנטית רלוונטית למספר יישומים מדעיים או רגולטוריים.
יש כמה ראיות לכך שדנ"א מהונדס מגידולים מהונדסים גנטית יכול להיות מופנם לגנומים של אוכלוסיות גידולי בר. לדוגמה, מאביקים עשויים להקל על העברה זו על ידי דישון צמחים מסוג בר עם אבקה ממקור מהונדס גנטית. זוהי דאגה, שכן ההשפעות של התפשטות הגנים המוחדרים האלה על מערכות אקולוגיות בכללותן אינן מובנות היטב. בדיקת PCR של אוכלוסיות בר יכולה לספק נתונים על ההתפשטות הפוטנציאלית, או בלימה מוצלחת, של תוספות גנטיות.
חוסר תיוג, או תיוג שגוי של מרכיבים מהונדסים גנטית יכול להיות דאגה הצרכן. ייתכן שהסיבה לכך היא העדפת הצרכן לצריכה, או הקדמה פוטנציאלית של אלרגנים במהלך תהליך GM, אם כי האחרון שנוי במחלוקת. במדינות מסוימות, מרכיבים מהונדסים גנטית נדרשים להיות רשומים על אריזות מזון. לוחות רגולציה במדינות כאלה עשויים להשתמש בבדיקות PCR כדי לבדוק את הדיוק של תיוג מזון.
כאשר השינוי הגנטי שהוכנס לגידול מעניק עמידות לחומרי הדברה, כמה מחקרים העלו חששות לגבי ייצור "עשבי-על". בעיקרו של דבר, אלה יכולים להיות כל צמח לא בתחילה ממוקד לשינוי המקבל את ההתנגדות לחומרי הדברה באמצעות מנגנונים כגון חדירה או הכלאה. צמחים אלה עשויים להיות מסוגלים להתפשט בהצלחה רבה יותר, ולהיות קשה יותר לשלוט מאשר אלה ללא תוספת. בדיקת PCR לשינוי גנטי יכולה לעזור להדגיש ולעקוב אחר אוכלוסיות פוטנציאליות כאלה כדי לקבוע אם התפשטות זו יכולה להיות בעייתית.
הרגע צפיתם בהקדמה של ג'וב לבדיקת מזון מהונדס גנטית. עכשיו אתה צריך להבין את העקרונות מאחורי זיהוי מזונות מהונדסים גנטית באמצעות PCR, כיצד לחלץ ולהגביר DNA ממזון, וכיצד לקבוע אם דגימת המזון שלך כבר מהונדס גנטית. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
לאחר destaining, ג'לים ניתן לנתח על ידי התבוננות בנתיבימזון בדיקה( טבלה 3 ) כדי לקבוע אם רצועות ה- DNA עבור גנים מקדם 35S ו- NOS שליחות קטלנית נמצאים במקומות הידועים על הג'ל. הנחת הג'ל על קופסת אור UV יכולה לעזור לספק ניגודיות מוגברת(איור 1). לחלופין, ניתן להניח ג'לים על נייר לבן או צהוב כדי לספק רקע מנוגד להדגשת רצועות DNA (איור 2).
איור 1. ג'ל מושפל המציג רצועות נפרדות של דנ"א. ג'ל אגרוז בעקבות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז על תיבת אור UV.
איור 2. דיאגרמה של מיקומים ידועים עבור מקדם 35S ו- DNA שליחות קטלנית NOS. נוכחות או היעדר של רצועת 200 bp בנתיב 5 מציינת אם מזון הבדיקה מכיל הורים מהונדסים הורים מהונדסים ותומיים.
| נתיב 1: מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים צמחיים | 455 לפנה"ס |
| נתיב 2: מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים מהונדסים גנטית | אין להקה |
| נתיב 3: בדיקת מזון עם פריימרים צמחיים | 455 לפנה"ס |
| נתיב 4: בדיקת מזון עם פריימרים מהונדסים גנטית | 200 bp או לא להקה |
| נתיב 5: תבנית חיובית ל- GMO עם פריימרים לצמחים | 455 לפנה"ס |
| נתיב 6: תבנית חיובית ל- GMO עם פריימרים מהונדסים גנטית | 200 לפנה"ס |
| נתיב 7: סרגל משקל מולקולרי PCR | 1,000, 700, 500, 200, 100 bp |
טבלה 3. גדלי פס לדוגמה PCR (זוגות בסיס (bp)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) משמשת להגברת ה- DNA, ומאפשרת מגוון רחב של בדיקות מעבדת DNA. תחום אחד של בדיקות אפשרי עכשיו עם PCR הוא לזהות הנדסה גנטית על ידי בדיקה לנוכחות או היעדר רצפי DNA המשמשים בשינוי הגנטי של גידולי מזון. בדרך כלל, יבול מהונדס גנטית כדי להעניק יתרון נגד הרתעה טבעית לתפוקות אידיאליות, למשל מזיקים (איור 3),מחלות, תנאי בצורת(איור 4)וכו '. מכיוון שהיתרון הוא על ידי החדרת חומר גנטי ממין אחר לדנ"א של צמח היבול עצמו, זוהו סיכונים פוטנציאליים לבריאות האדם ולסביבה עם השימוש בהנדסה גנטית. דאגה סביבתית אחת היא היכולת של הדנ"א מהונדס גנטית להיות מוחלף בשוגג באמצעות תהליכי האבקה, אשר יכול להוביל DNA מהונדס גנטית להיכנס הגנום של יבולים שנועדו להימכר כמו הנדסה גנטית.
איור 3. זחלים של קולורדו, עלים טורפים של תפוח אדמה.
איור 4. תירס נהרס על ידי בצורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
