Overview
资料来源： 玛格丽特工人和金伯利弗莱-Depaul 大学实验室
基因改造食品一直有争议的问题，由于辩论关注健康和环境安全。本实验演示技术理解的如何食品 DNA 基因识别，允许在受教育决定制作有关安全和潜在危险的使用转基因改性生物 (GMOs) 食品供应。
聚合酶链反应 (PCR) 用于放大食品 DNA 来测试食物产品中的转基因 DNA 的存在。用凝胶电泳拉通过 3%琼脂糖凝胶，浓度足够密集的分离 DNA 含有转基因的 DNA 的乐队的 DNA 提取的食品检测到存在特异性的 DNA 条带。几个控件在电泳过程中用于确保从测试食品 （植物底漆），成功地提取 DNA 和基因提供已知的两个例子修改 DNA （购买转基因的 DNA） 和非转基因 DNA （购买经认证的非转基因食品控制）。
Principles
聚合酶链反应 (PCR) 标识已经被插入到转基因植物的 DNA 序列。与蛋白质，DNA 是一种相对稳定的分子，因此 DNA 片段可以被隔离从高度加工的货物，足以完好无损，pcr 扩增。遗传工程师使用只有少量的调控序列 （启动子和终结器序列） 来控制插入的基因的表达，所以这些序列共同对转基因作物的绝大多数。在此过程中确定的两个序列是最常见的调控序列，其中合酶 (NOS) 终结者基因的农杆菌介导和花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S 启动子基因的两个。
聚合酶链反应涉及到重复的周期，每个模板变性、 和组成的引物退火，退火引物延伸Taq DNA 聚合酶。一旦从食物中提取 DNA，热循环用于快速操作温度，导致 PCR 周期的阶段。
当样品迅速加热到 94 ° C，导致 dna 分离时发生变性阶段。快速冷却到 59 ° C 允许引物退火到分离的 DNA 链，然后加热到Taq DNA 聚合酶延长的引物，使每个 DNA 链的完整副本和完成一个热循环 72 ° C。
然后可以通过琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA 的可见识别 35S 启动子基因和 NOS 终止与运行扩增的 DNA。扩增的 DNA 被加载到另一端的凝胶，井使用有助于权衡下采样以防止溶解入缓冲区中，周围的购买的加载染料。加载染料还提供视觉，所以 DNA 的运动可以看到在电泳技术在染料"战场"。电泳过程通过使用电流分离成阴极和阳极的结束工作。DNA 加载到接近会议厅，阴极侧一端凝胶和负电荷的 DNA 被吸引到了阳极室和通过琼脂糖被拉扯。大序列的 DNA （碱基对的数目增加） 不能一样轻松地通过琼脂糖和将分离出来早，虽然规模较小的序列能够沿着往阳极结尾凝胶传播得更远。
染色的过程有助于通过绑定到 DNA 以添加背景凝胶和 DNA 为更好地可视化的结果，银行之间的对比。使用提供的每个测试凝胶可以分析存在或缺乏 35S 启动子和 NOS 终结者基因的 DNA 序列的不同规格的已知的位置。
控件用于以确保正确提取 DNA 并提供测试食物样本进行比较。购买的工厂底漆被添加到每个样品提供核酸共同所有的植物。这允许 DNA 提取过程中，质量控制检查，因为任何植物中提取的 DNA 应扩大与此引物在 PCR 过程中，应该也看到在凝胶电泳完毕后。作为阳性对照，35S 和 NOS 基因购买底漆用于提供 DNA 带胶基因改造。如果转基因阳性模板控制并不健全，还有一个问题与 PCR 反应和从测试食品转基因阴性结果不能被信任。认证的非转基因食品产品也是购买和使用作为阴性对照显示时没有转基因的材料是目前分离 DNA 的样子。
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Procedure
1.从食品样品中 DNA 提取
- 每个使用转让吸管或 200 1,000 µ L 可调音量微管吸吮 2 螺旋帽管添加 500 µ L 的购买 PCR 混合矩阵。与之间每个分装均匀混合的 PCR 矩阵吸管吸管向上和向下。
- 标签一螺旋帽管"非转基因"和其他"测试"。
- 称出 0.5 g 认证的非转基因食品，放入砂浆。
- 添加 2.5 毫升的蒸馏水和磨碎用杵 2 分钟，形成浆料。
- 添加另一个 2.5 毫升的蒸馏水和继续用杵研磨，直到浆变得不够平滑，吸管。
- 吸管 50 µ L 地面泥浆对螺旋帽筒内装 500 µ L PCR 预混料的标记为"非转基因"使用 50 µ L 标记上毕业的吸管。回顾一下管。
- 重复步骤 1.3-1.6 准备测试食品样品。
- 吸管 50 µ L 地面测试食品泥浆对螺旋帽管的标记为"测试"。回顾一下管。
- 涡非转基因食品和试验食品 PCR 管 1 分钟和地方管在 95 ° C 水浴 5 分钟。如果没有涡是可用的几次轻弹管混合前放置在水浴中。
- 将管放在离心机为 5 分钟。固体颗粒应形成底部的管。如果 5 分钟后，再一次为 2 分钟的时间间隔，直到颗粒形成离心机不形成颗粒。
- 可以立即用于 PCR 管，或存于冰箱 1 周。
2.设置 PCR 反应
- 数字 PCR 管 1 — — 6 和最初的他们。数字应对应于表 1中列出的以下管内容。
- 将每个标记的 PCR 管放置在带盖打开的微细管持有人。
- 为每个添加使用新鲜的提示，添加 20 微升向每个 PCR 管表示对表 1的底漆。帽管。
- 每个管使用新鲜的提示，添加 20 微升的向每个 PCR 管，一定要只从上清液吸管和避免固体颗粒在管底部表示对表 1的 DNA 样本。
- 每个 DNA 样本吸取到相应的 PCR 管后，用移液管 DNA 和底漆用枪吹打混轻轻向上和向下;回顾一下管。
- PCR 管置于热循环中，程序的循环：
初始的变性： 1 周期在 94 ° C 为 2 分钟。
放大： 40 周期在 94 ° C 1 分钟 （变性），59 ° C （退火），1 分钟和 2 分钟 （扩展） 72 ° C。
最后一次延长： 1 周期为 10 分钟，72 ℃。
举行： 4 ° C 无限期。
3.3%琼脂糖凝胶制备
- 使用实验室或美纹胶带、 安全地开放端粒胶盘磁带。确保磁带密封的纸盒，防止熔琼脂糖中漏出来的边缘。
- 称出 3g 的琼脂糖凝胶成 250 毫升或更大的锥形瓶。
- 添加 1 x TAE 缓冲区 （购买或准备从精矿） 100 毫升。
- 磁热板用搅拌棒，加热烧杯，直到琼脂糖完全溶解在缓冲区中，解决方案把水煮沸，得一清二楚。或者，将烧杯放在烤箱和加热 30 s 间隔，用搅拌棒拌每 10 s，重复，直到沸腾混合物和轮流明确可以使用一台微波炉。
- 转化成 250 毫升瓶作为回流，防止琼脂溶液蒸发开幕 50 毫升锥形瓶。
- 允许琼脂溶液冷却到 60 ° C，并倒入每个录音的胶盘 30-50 毫升。
- 将凝胶梳子放入凹槽打造凝胶井的第一双。
- 允许凝胶完全冷却前删除磁带和梳子。凝胶将巩固和从明确转阴天时准备好，大约 10-20 分钟。
4.的 PCR 产物电泳
- 放置在一个凝胶托盘上的预制的 3%琼脂糖凝胶或用已被用于铸造浇的 3%琼脂糖凝胶电泳凝胶托盘。
- 凝胶托架滑入电泳室井接近阴极 （黑色） 结束。
- 倒入分庭，足够有 2 毫米的缓冲胶盘上方 1 x TAE 缓冲区。
- PCR 管得到的热循环和微管的持有人的地方。
- 每次使用新鲜针提示，添加的加载染料 (LD) 对每个样本的购买橙 G 10 微升，拌匀。
- 负荷 20 微升的分子量标尺和每个样品到顺序凝胶 20 微升表示 (表 2)。
- 在 100 V 运行 30 分钟凝胶电泳。
- 从分庭和幻灯片的凝胶，从纸盒中取出删除凝胶托盘。将凝胶放在染色的托盘。
- 沉浸在购买 DNA 凝胶染色为 5 分钟，仔细地震动盘帮助分发整个凝胶染色的凝胶。
- 将凝胶转移到清洗容器和冲洗用自来水 (40-55 ° C) 为大约 10 s。
- 为获得最佳效果下轻轻摇动每 6 分钟的温暖自来水中洗 3 x destain。如有必要，继续脱色在温暖的水中，直到达到所需的对比度。
| 管数 | 底漆 | Dna 样本 |
| 1 | 20 微升植物底漆 （绿色） | 20 微升非转基因食品控制 DNA |
| 2 | 20 微升转基因底漆 （红色） | 20 微升非转基因食品控制 DNA |
| 3 | 20 微升植物底漆 （绿色） | 20 微升测试食品 DNA |
| 4 | 20 微升转基因底漆 （红色） | 20 微升测试食品 DNA |
| 5 | 20 微升植物底漆 （绿色） | 20 微升转基因阳性对照 DNA |
| 6 | 20 微升转基因底漆 （红色） | 20 微升转基因阳性对照 DNA |
表 1。列表中的适当管数字、 引物和 DNA 样本。
| 1 井 | 样本 1 非转基因食品控制与植物引 20 微升。 |
| 2 井 | 样本 2 非转基因食品控制与转基因引 20 微升。 |
| 3 井 | 样本 3 测试食物与植物引 20 微升。 |
| 4 井 | 示例 4 测试食品与转基因引 20 微升。 |
| 5 井 | 示例 5 转基因阳性 DNA 与植物引 20 微升。 |
| 6 井 | 示例 6 转基因阳性 DNA 与转基因引 20 微升。 |
| 7 井 | 聚合酶链反应分子量标尺 20 微升。 |
| 8 井 | 请留空。 |
表 2。适当的顺序加载到凝胶 20 微升的分子量标尺和每个样本的 20 微升。
转基因的食品都含有一种成分或具体说来改变了其 DNA 的成分的产品。可以使用一种叫做聚合酶链反应技术检测到这些修改的存在。
基因改造食品一直有争议的问题，由于辩论关注健康和环境安全。能够检测基因改变的 DNA 的感兴趣的食物样本中允许为教育决策有关安全和潜在危险的使用基因改良生物体或转基因生物的在食物供应。
聚合酶链反应或 PCR，用于放大 DNA 以确定存在转基因序列的食物。凝胶电泳然后拉扩增的 DNA，通过琼脂糖凝胶基质和分离对应修改过的或非修改标记的不同大小的 DNA 条带。这些然后相比控制乐队从已知含有转基因的食品或已知是免费修改。
样品、 如何提取 DNA 和放大标记用于在基因改造过程中，以及如何建立食品样品中存在与否转基因生物的这个视频将说明检测转基因的 DNA 从食物背后的原则。
聚合酶链反应用于标识已经被插入到转基因食品的 DNA 序列。DNA 是一种相对稳定的分子，所以可行适用于扩增的 DNA 片段可以孤立甚至从高度加工处理的货物，像玉米片或蔬菜汉堡。
少量的调控 DNA 序列用于控制插入基因的表达，所以这些序列是目前在大部分的转基因作物。此过程标识的最常用的两个，35S 启动子基因和其中合成酶终结者基因。35S 序列是一个强启动子和附加到插入的基因时将驱动器恒、 高层次的表达。其中合酶终止符是基因的包括停止所需的终结点上插入的转录。
聚合酶链反应涉及重复加热和冷却循环中的热循环，严格控制温度的 PCR 反应管机。加热样品到 94 ° C 会导致 dna 变性和分离。快速冷却到 45 至 65 °C允许引物退火到分离的 DNA 链。最后，再加热到 72 °C允许Taq聚合酶延长的引物和完整重复的目标区域。
购买的植物底漆添加到每个样品，和将放大中含有植物 DNA 样品。转基因 35S 和 NOS 阳性模板用于转基因生物为提供积极的控制。经认证的非转基因作为阴性对照。如果任何这些控制反应显示意外的乐队，测试样本的结果不能被信任。
扩增的 DNA 是运行通过琼脂糖凝胶电泳。PCR 产物是掺染料和加载到井。DNA 带负电荷的离子，和电流后，当加载到末尾阴极室凝胶将移向阳极结束。更大的 DNA 片段不能移动很容易通过凝胶矩阵所以都会留接近阴极，虽然规模较小的序列将移向阳极结束，导致在不同大小的 DNA 分离成不同的乐队。
后电泳，凝胶染色有助于直观显示分离的 DNA 条带。
现在，我们熟悉了转基因生物检测和 PCR 和电泳用于转基因标识背后的原理，让我们看看如何这可以进行在实验室里。
一旦已经确定食品类产品感兴趣，就可以开始分析。要提取 DNA，两个干净的瓶盖管，一并进入每个这些转让 500 μ L 的购买 DNA 分离试剂，并确保上下之间整除数均匀混合试剂混匀。标签一管"非转基因"，和其他的"测试"。
下一步，称出 0.5 g 认证的非转基因食品，并将放入干净的砂浆。添加 2.5 毫升的蒸馏水，并与 2 分钟，形成浆杵研磨。添加另一个 2.5 毫升蒸馏的水，继续磨浆，直到它变得顺利，足以移液器。
移液器已知非转基因泥浆对"非转基因"标记包含 DNA 分离试剂瓶盖管 50 μ 的 L。现在添加测试食品样品浆 50 μ L 标记为"测试"瓶盖管。涡两管含有的食物样本和 DNA 试剂 1 分钟。下一步，在 5 分钟，95 ℃ 的水浴中放置管。最后，将管放在离心机为 5 分钟。经检验后，应在管底部形成固体颗粒。如果 5 分钟后，再一次为 2 分钟的时间间隔，直到颗粒形成离心机不形成了一个球。样品现在可以立即用于 PCR，或存于冰箱 1 周。
第一，第六个 PCR 管。这些数字将对应于表中列出的管内容。将每个标记的 PCR 管放在带盖打开的微细管持有人。
为每个添加使用新鲜的提示，添加到每个 PCR 管表中所列 20 μ L 底漆。接下来，添加到每个 PCR 管表所示的 DNA 样品 20 μ L。吸管向上和向下混合。丸粒化样品，一定要只从上清液，吸管，避免管底部的固体颗粒。最后，将 PCR 管放入热循环和程序它以循环加热和冷却的表中所列的步骤。
置于 3%琼脂糖凝胶电泳室井接近阴极末端。将泰缓冲区添加到会议厅，以覆盖胶盘上方 2 毫米。PCR 管收集热循环仪，并将它们放在一个微管持有人。每次使用新鲜针提示，加入 10 μ L 的购买加载染料对每个样本的 DNA，拌匀。
每次使用新鲜的提示，装入 20 μ L 的分子量标尺的琼脂糖凝胶井一口井和每个样品到随后的井，20 μ L 此表所示。设置电泳室运行在 100 V 为 30 分钟。
一旦这种凝胶已完成运行，仔细地拔下凝胶分庭、 卸下纸盒，并滑入染色的托盘的凝胶。沉浸在购买 100 x 5 分钟震动盘轻轻地分发染色凝胶染色凝胶。一旦沾上，将凝胶转移到清洗容器和冲洗用自来水约 10 s.Destain 通过洗三次 3 分钟温暖自来水中每个，每个轻轻摇动为获得最佳效果。如有必要，继续脱色在温暖的水中，直到达到所需的对比度。
在车道 4 200 bp 乐队的存在与否指示是否检测食品中含有转基因生物。植物引物确定是否植物 DNA 成功提取样品。非转基因食品控制是一项指标的假阳性的结果，他们应该发生。如果非转基因食品控制出来是积极的它意味着 PCR 被污染在一些点。转基因阳性模板控件是假阴性率指标。如果转基因阳性模板控制并不健全，还有一个问题与 PCR 反应和从测试食品转基因阴性结果不能被信任。
凝胶可以放在白色或黄色的纸，以提供背景形成对比，以突出显示 DNA 条带，或可利用紫外线灯箱实现增加的对比度。
测试食品或转基因成分的产品的能力是相关的科学或规管的申请数目。
还有一些证据表明，转基因作物转基因 DNA 可以成为渗入到的野生作物群体的基因组。例如，传粉者可能以这种转移施肥野生型植物的花粉从一个转基因的来源。这是传播的一个问题，因为这些插入的基因，对生态系统作为一个整体的影响还不太清楚。聚合酶链反应检测野生种群可以提供关于潜在传播或成功遏制，基因插入数据。
缺乏的标签，或不正确标记的转基因成分可以是消费者关注的。虽然后者是有争议的这可能是由于消费，消费者的偏好或过敏原在通用汽车的过程中，可能会引入。在一些国家，转基因的成分均须在食品包装上列出。管理委员会在这些国家可能使用 PCR 检测，检查食品贴标精度。
凡介绍给作物的遗传修饰授予抗药性，一些研究已经提出对生产的"超级杂草"的担忧。基本上，这些可以是任何一种植物不最初的目标是通过导入或杂交等机制获得农药抗性的修改。这些植物可能能够传播更成功，然后，要比那些没有插入到控件。聚合酶链反应检测基因改造可以帮助突出显示并跟踪这种潜在的种群，以确定是否这一利差可能会引起问题。
你刚看了朱庇特的简介测试对转基因食品。你现在应该明白确定转基因的食品使用 PCR、 如何提取和放大 DNA 从食物中，以及如何确定您的食品样品有转基因背后的原则。谢谢观赏 ！
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Results
脱色后, 凝胶可以分析看测试食物车道 (表 3)，以确定是否为 35S 启动子和 NOS 终结者基因 DNA 乐队目前在凝胶上的已知位置。这种凝胶置于紫外线灯箱可以帮助提供增加的对比度 (图 1)。另外，凝胶可以放在白色或黄色的纸，以提供背景形成对比，以突出显示 DNA 带 (图 2)。
图 1。显示分隔带的 DNA destained 的凝胶。琼脂糖凝胶上紫外线灯箱后琼脂糖凝胶电泳。
图 2。图为 35S 启动子和 NOS 终止 DNA 的已知位置。在车道 5 200 bp 乐队的存在与否指示检测食品中含有转基因生物。
| 车道 1:非转基因食品植物引物 | 455 bp |
| 车道 2:非转基因食品与转基因引 | 没有乐队 |
| 车道 3:与植物引物的检测食品 | 455 bp |
| 车道 4:测试食品与转基因引 | 200 bp 或没有乐队 |
| 5 巷：用植物引转基因阳性模板 | 455 bp |
| 巷 6:用转基因引转基因阳性模板 | 200 bp |
| 车道 7:聚合酶链反应分子量标尺 | 1,000、 700、 500、 200、 100 bp |
表 3。聚合酶链反应样品带大小 （碱基对 (bp)）。
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Applications and Summary
聚合酶链反应 (PCR) 用于放大 DNA，使 DNA 宽范围的实验室测试。在粮食作物的遗传修饰使用的测试现在可能与 PCR 是确定转基因生物检测所存在或缺席的 DNA 序列的一个区域。通常情况下，作物被转基因赋予反对自然威慑到理想的收益率，例如害虫 (图 3)、 疾病、 干旱条件下 (图 4) 等优点。通过从一个不同的物种中遗传物质插入作物植物的 DNA，得到了好处，因为潜在的人类健康和环境风险方面已与使用转基因生物。一个环境的关注是转基因 DNA 通过授粉过程，可能会导致转基因 DNA 进入的作物基因组打算作为非转基因生物出售无意中交换的能力。
图 3。幼虫的科罗拉多甲虫，吞噬的马铃薯叶子。
图 4。玉米因干旱。
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