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접촉 슬라이드 분석 및 현미경을 통한 토양 미생물 시각화
 
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접촉 슬라이드 분석 및 현미경을 통한 토양 미생물 시각화

Overview

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠

토양은 생명에 기여하는 생체 및 무생물 요인을 포함하는 지구 표면의 얇은 층을 포함한다. 상기 비생물부는 토양의 질감을 결정하는 크기와 모양에 이르는 무기 입자를 포함한다. 바이오틱 부분은 식물 잔류물, 뿌리, 유기물 및 미생물을 통합합니다. 토양 미생물의 풍부와 다양성은 토양 1 그램이 포함으로 광대 하다 107-8 박테리아, 106-8 actinomycetes, 105-6 곰팡이, 103 효모, 104-6 원생 조아, 103-4 조류, 53 선충. 함께, 생물학적 및 생물학적 요인은 토양 미생물에 유리한 조건을 제공하는 뿌리 권구로 알려진 식물 뿌리 의 주위에 건축을 형성합니다.

생물학적 및 비생물적 요인은 토양의 삶을 촉진합니다. 그러나, 그(것)들은 또한 미생물을 제한하는 스트레스역학을 기여합니다. 생물학적 스트레스는 환경 조건에서 적응하고 살아남기 위해 삶 간의 경쟁을 수반합니다. 예를 들면, 미생물은 이웃 미생물을 해치기 위하여 억제 물 또는 독성 물질을 분비할 수 있습니다. 페니실륨 노타텀은 인간이 약제페니실린을 만들기 위해 수확하는 항균체를 생산하여 영양소에 대한 경쟁을 감소시키기 때문에 악명 높은 곰팡이입니다. 비생물학적 스트레스는 빛, 수분, 온도, pH, 영양소 및 질감과 같은 미생물 생존을 제한하는 물리적 또는 화학적 특성에서 발생합니다.

Principles

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다양한 토양 환경 내에서 토양 생물, 입자 및 행동 간의 상호 관계를 직접 관찰하는 것은 어렵지만, Rossi et al.(1936)에 의해 개발된 매장 슬라이드 기술로알려진 접촉 슬라이드 분석법은 토양 미생물학으로의 스냅샷 관점을 제공한다. 이 방법은 미세 검사를 통해 토양 곰팡이, 액티노마이트 및 박테리아를 관찰하는 데 유용합니다. 비록, 그것은 미생물 정수에 대 한 의도 되지 않습니다., 그것은 단지 더 큰 이질적인 환경의 하나의 작은 부분을 의미.

이 방법은 며칠 동안 유리 슬라이드를 토양에 묻고 아세트산으로 슬라이드에 미생물을 고정하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 미생물은 로즈 벵골 염료로 염색되고 100X 목표에 기름 침수를 사용하여 현미경 을 통해 관찰됩니다. 박테리아가 작은 둥근 모양으로 나타나고, 얇은 문자열로 작용성 필라멘트, 곰팡이 최면이 두꺼운 실로 나타나기 때문에 3 개의 미생물 그룹을 구별 할 수 있습니다. 토양에서, 거의 모든 박테리아는 영양 스트레스로 인해 순수한 문화에 있는 그들 보다는 작고 둥글게, 더 유리한 표면에 대 한 축소 및 반올림 원인: 볼륨 비율. 얼룩되지 않은 불규칙한 어두운 모양은 토양 입자입니다. 상이한 영양소 수정은 미생물 성장과 상호 작용을 촉진하는 탄소 및 포도당 소스를 제공하기 위해 토양에 첨가될 수 있다. 이 기술은 토양 미생물학의 쉬운 관찰을 허용하고 환경에 존재하는 몇몇 유기체를 확인하는 것을 돕습니다.

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Procedure

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1. 토양 슬라이드 소우주 준비

  1. 표면 (0-6"깊이)에서 정원 토양을 수집하고 150g 토양을 두 개의 별도 컵으로 무게.
    1. 토양에 유기물의 밀도가 높은 경우 무게는 100g입니다.
  2. 한 컵 "치료"와 다른 "제어"라고 레이블을 지정합니다.
  3. 수분 함량을 변경하는 데 필요한 양의 물을 계산합니다.
    1. 수분 함량은 종종 현장 용량에 가깝습니다.
      Equation 1 1
  4. 졸업한 실린더로 증류수의 양을 측정합니다.
  5. 증류수 양을 두 개의 바이알에 붓습니다.
  6. 하나의 유리병 "치료"와 다른 "제어"를 라벨.
  7. "치료" 토양의 건조 중량 기준에 따라 1%의 최종 토양 포도당 농도에 대한 충분한 포도당으로 "치료" 유리병에서 물을 수정합니다.
  8. 200 mg NH4NO3을 "치료"유리병에 넣고 개정을 용해하기 위해 저어줍니다. 질산염은 토양 미생물을 위한 양분의 질소 근원 역할을 합니다.
  9. "제어" 바이알을 수정하지 마십시오.
  10. 약 50 mg의 작은 알리쿼트에서 "치료"유리병의 내용을 "치료"컵에 섞습니다. 각 알리쿼트 추가 후 주걱으로 저어.
  11. 작은 알리쿼트에서 "컨트롤" 유리병의 내용을 "컨트롤" 컵에 섞습니다. 각 알리쿼트 추가 후 주걱으로 저어.
  12. 4개의 깨끗한 현미경 슬라이드를 라벨: 2개의 "처리" 및 2개의 "제어" 슬라이드.
  13. "처리" 슬라이드 두 개를 "처리" 토양 컵에 삽입하고 두 개의 "제어" 슬라이드를 "제어" 토양 컵에 삽입합니다. 각 슬라이드의 2cm를 토양 표면 위에 투사하고 두 슬라이드 사이에 간격을 두십시오.
  14. 컵에 플라스틱 랩으로 덮고 고무 밴드로 고정하십시오.
  15. 공기를 허용하기 위해 랩을 여러 번 뚫지만 과도한 증발을 방지합니다.
  16. 두 컵의 무게를 기록합니다.
  17. 7일 동안 지정된 구역/인큐베이터에서 토양으로 채워진 컵을 실온에서 배양합니다.

2. 슬라이드 염색 및 현미경 검사법

  1. 두 컵의 무게를 기록합니다.
  2. 슬라이드 제거 시 토양 수분을 계산합니다.
  3. 각 슬라이드를 경사 위치로 누르고 철회하여 각 컵에서 두 개의 슬라이드를 제거하여 슬라이드의 위쪽 면이 방해받지 않도록 합니다.
  4. 슬라이드의 측면을 식별하고 표시하여 염색하고 관찰합니다.
  5. 벤치 상단의 슬라이드를 부드럽게 탭하여 큰 토양 입자를 제거합니다.
  6. 젖은 종이 타월을 사용하여 슬라이드의 아래쪽 면을 청소하십시오. 실온에서 슬라이드를 건조시다.
  7. 보호 고글을 착용하고 각 슬라이드를 집게로 잡고 슬라이드를 40 % (v /v) 아세트산에 넣고 연기 후드 아래에서 1-3 분 동안 담급니다.
  8. 부드러운 물 줄기 아래에서 여분의 산을 씻어 내보냅니다.
  9. 드롭퍼 병을 사용하여 슬라이드 표면을 페놀 로즈 벵골으로 덮습니다. 용기 위에 얼룩진 랙의 슬라이드를 지원하여 과도한 얼룩을 잡습니다. 슬라이드 표면에서 미생물을 제거 할 수있는 힘으로 씻지 마십시오.
  10. 5-10 분 동안 슬라이드를 염색하십시오. 필요에 따라 더 많은 얼룩을 추가합니다.
  11. 슬라이드를 부드럽게 씻고 과도한 얼룩을 제거합니다.
  12. 실온에서 슬라이드를 건조시키십시오.
  13. 오일 침지 목표를 사용하여현미경(도 1)을사용하여 슬라이드를 관찰한다.

Figure 1
그림 1. 현미경 아래 슬라이드.

토양의 다양한 유기체와 무기 성분 간의 관계는 토양 변화와 환경 스트레스를 이해하는 데 필수적이지만 직접 시각화없이는 해명 될 수 없습니다.

토양, 매우 복잡한 시스템, 다양한 생물의 수백만에 대한 서식지입니다. 특히 뿌리뿌리라고 불리는 식물 뿌리 를 중심으로 토양의 영역은 식물 뿌리에 의해 직접적으로 영향을 받는 독특한 유기체배열을 함유하고 있다.

뿌리 줄기권의 비생물학적, 또는 비생물학적 성분은 토양의 질감에 기여하는 크기와 모양에 이르는 무기 입자를 포함한다. 생물학적, 또는 생물학적, 부는 식물 잔류물, 뿌리, 유기물 및 미생물을 포함한다.

이 비디오는 토양 변화에 영향을 미치는 요인을 이해하고 환경 스트레스를 예측하기 위해 뿌리 근위권 토양의 생물학적 및 생물학적 성분의 직접적인 시각화를 보여줍니다.

미세한 유기체는 토양 모공 내에 있는 물에 상주하는 경향이 있습니다. 박테리아는 토양에 존재하는 가장 간단하고 가장 풍부한 유기체 중 하나이며, cocci라는 구체, 바실리라고 하는 막대 및 필라멘트 형태를 포함하여 많은 형태에서 발견됩니다.

효모와 곰팡이와 같은 곰팡이 종은 토양에서 두 번째로 풍부한 유기체입니다. 그들은 죽은 유기물을 분해하고 재활용하기 위해 노력합니다. 현미경 필라멘트 균류는 포자를 방출하는 길고 분지 된 최면을 가지고 있기 때문에 시각적으로 다른 미생물과 시각적으로 다릅니다.

이러한 유기체 사이의 관계의 직접적인 관찰은 도전적이지만 접촉 슬라이드 분석을 사용하여 달성 될 수 있습니다. 이 방법은 며칠 동안 유리 슬라이드를 토양으로 잠그고 유기체및 토양 입자가 슬라이드 표면에 흡착하도록 하여 수행됩니다.

그런 다음 슬라이드를 비스듬히 제거하여 표면의 번짐을 방지합니다. 미생물은 아세트산으로 고정되고, 가벼운 현미경 검사를 통해 시각화를 가능하게 하기 위하여 로즈 벵골 얼룩으로 얼룩됩니다.

이제 접촉 슬라이드 분석 기술의 원리를 이해되었으므로 실험실의 프로세스를 살펴 볼 수 있습니다.

첫째, 표면 정원 토양을 수집하고 실험실로 토양을 전송합니다. 2 개의 별도 용기에 토양 150 g의 무게. 하나의 용기는 유기체의 급속한 증식을 장려하기 위하여 양분으로 변형될 처리 견본으로 표시되어야 합니다. 다른 컨트롤에 레이블을 지정하여 변경되지 않습니다.

토양 비디오에서 이 컬렉션의 수분 함량 측정에 표시된 기술을 사용하여 토양의 수분 함량을 계산합니다. 이 계산에 기초하여, 건조 중량 기준으로 토양에 있는 물의 양을 결정합니다. 이제 15%의 토양 수분 함량을 제공하기 위해 추가해야 하는 물의 양을 계산합니다. 이것은 미생물 성장에 최적, 필드 용량에 수분을 제공합니다.

졸업한 실린더를 사용하여 계산된 증류수를 측정합니다. 계산된 양의 물을 각 용기에 붓습니다. 토양의 이전에 결정된 건조 중량에 기초하여, 건식 중량 기준을 사용하여 질량별로 1%의 최종 토양 포도당 농도를 달성하는 데 필요한 포도당의 양을 계산한다. 포도당의이 금액을 무게와 치료 용기에 추가합니다.

질산 암모늄 200 mg의 무게를 측정한 다음 치료 용기에만 추가하십시오. 질산암모늄은 토양 미생물의 질소 영양공급원역할을 합니다. 토양, 포도당 및 질산암모늄 혼합물을 용기에 섞는다.

다음으로, 라벨 4 깨끗한 현미경 슬라이드: 치료로 2, 대조군으로 두. 두 처리 슬라이드를 처리 토양 용기에 삽입합니다. 각 슬라이드의 단면을 토양 표면 위에 노출시키고 두 슬라이드 사이에 간격이 있는지 확인합니다.

두 컨트롤 슬라이드를 같은 방식으로 제어 토양 용기에 삽입합니다. 컵에 플라스틱 랩으로 덮고 고무 밴드로 고정하십시오. 공기 전송을 허용하지만 여전히 과도한 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장을 여러 번 펑크.

마지막으로, 두 컵의 무게를 모두 무게, 자신의 무게를 기록하고, 7 일 동안 실온에서 지정된 지역에서 인큐베이팅.

7일 간 인큐베이션 후 토양 컵을 계량하여 토양 수분 함량을 계산합니다. 물 증발로 인해 체중이 손실되었는지 확인하고 필요한 경우 물을 교체하십시오.

용기에서 플라스틱 랩을 제거하고 각 슬라이드를 경사 위치로 누르고 슬라이드의 위면이 방해받지 않도록 철회하여 토양에서 두 개의 슬라이드를 제거합니다.

슬라이드를 부드럽게 눌러 큰 토양 입자를 제거합니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 슬라이드의 아래쪽 면을 청소하십시오. 연기 후드에서 실온에서 건조할 수 있습니다. 일단 건조하면, 집게로 슬라이드를 집어 들고 1~ 3 분 동안 아세트산에 담가.

슬라이드 의 상단을 증류수의 부드러운 스트림으로 헹구어 과도한 산을 제거합니다. 모든 슬라이드에 대해 이 단계를 반복합니다. 슬라이드를 공기 건조로 허용합니다.

용기 위에 스테인딩 랙의 슬라이드를 지원하여 과도한 염료를 잡습니다. 드롭퍼를 사용하여 각 슬라이드의 표면을 페놀 로즈 벵골 염료로 부드럽게 덮습니다. 슬라이드가 5~10분 동안 얼룩지게 하여 슬라이드를 젖은 상태로 유지하기 위해 필요에 따라 염료를 더 넣습니다. 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구어 과도한 얼룩을 제거하고 실온에서 슬라이드가 건조하도록 합니다.

오일 침지 목표를 사용하여 가벼운 현미경의 슬라이드를 검사합니다. 처리 된 토양은 더 많은 토양 미생물을 가질 것입니다.

일반적인 토양 견본에 있는 곰팡이와 세균성 유기체 사이 공간 상호 작용은 쉽게 시각화될 수 있습니다. 토양 입자는 어두운 불규칙한 모양을 표시합니다.

곰팡이 유기체는 두꺼운 필라멘트 최면을 표시하고, 액티노마이세트는 얇은 필라멘트 최면을 표시합니다.

박테리아는 토양 입자 또는 안감 곰팡이 최면에, 일반적으로 덩어리에서 작은 cocci 또는 막대 모양으로 발견된다.

토양에서 유기체의 직접 적인 분리는 토양과 환경 특성의 이해에 중요 하다.

내모 병원성 선충은 곤충을 기생시키는 미세한 둥근 벌레입니다. 접촉 슬라이드 분석에서 시각화되지는 않지만 이 예제와 같이 수집된 토양 샘플에서 분리할 수 있습니다.

첫째, 선충은 육각 검사에서 확인된 곤충을 사용하여 토양에서 미끼를 사용했습니다. 선충은 죽은 곤충 미끼로부터 고립되어 죽은 곤충을 습하고 어두운 환경에 배치하고 선충이 주변 물로 이주할 수 있게 함으로써 고립되었습니다. 선충은 그 때 물에서 집합하고 분석되었습니다.

필라멘트 균류는 영양 재활용에 대한 역할 때문에 토양 건강에 필수적입니다. 토양에서 필라멘트 균류의 격리 및 관찰이 예에서 수행되었다.

토양 샘플은 물로 희석하고, 별도의 멸균 로즈 벵골 연쇄상 구균 천 접시에 첨가되었다. 연쇄 상 균 증 박테리아 성장을 방지 하 고 곰 팡이 성장을 활성화. 곰팡이 식민지는 접착제 테이프를 사용하여 유리 슬라이드에 계산되고 장착되었습니다. 곰팡이는 가벼운 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다.

토양 미생물은 자연적으로 죽은 식물과 유기체와 같은 토양의 구성 요소를 분해합니다. 이 예에서 볼 수 있듯이 생분해성 플라스틱 필름의 생분해 및 식민지화를 검사했습니다.

곰팡이는 몇 달 동안 토양에 묻혀 플라스틱 필름에서 고립되었다. 곰팡이는 플라스틱 필름의 성장을 위해 개별적으로 테스트되었습니다. 플라스틱 필름은 곰팡이에 의해 플라스틱의 직접 분해를 관찰하기 위해 성장 매체없이 선택한 곰팡이 균주와 함께 배양되었다.

당신은 토양 미생물의 질적 이미징에 대한 접촉 슬라이드 분석에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 접촉 슬라이드를 준비하는 방법을 이해하고 토양 미생물을 시각화해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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곰팡이 디스플레이 두꺼운 필라멘트 최면(그림 2). 액티노미세테스는 얇고 필라멘트 하이픈을 표시합니다. 박테리아는 작은 코치 또는 막대 모양을 표시합니다. 그들은 종종 덩어리에서 발견, 토양 입자에, 또는 안감 곰팡이 최해. 토양 입자는 불규칙한 어두운 모양(도 3)을표시합니다.

Figure 2
그림 2. 100X 목표 렌즈를 사용하여 슬라이드 이미지를 접촉하십시오.
사진 제공: W.H. 풀러

Figure 3
그림 3. 100X 목표 렌즈를 사용하여 슬라이드 이미지를 접촉하십시오.
사진 제공: W.H. 풀러

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Applications and Summary

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매장 슬라이드라고도 하는 접촉 슬라이드 분석법은 토양 비오타를 질적으로 관찰하는 데 사용되는 간단한 기술이다. 이 분석은 질적으로 곰팡이 최해, 액티노미세테 필라멘트, 박테리아 및 토양 입자 사이의 공간 상호 작용을 보여줍니다. 개인이나 산업은 농업, 원예, 퇴비화, 교육 및 공부와 관련하여 특정 토양의 건강에 대한 지식을 수집하기 위해이 분석법을 사용할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 더 큰 이기종 환경의 작은 초상화를 포괄하기 때문에 토양 마이크로 비오타를 정량화하지 않습니다.

토양 유기체 관계는 접촉 슬라이드 분석법을 수행하고 100X 오일 침지 현미경 검사법(그림2 3)을통해 결과를 확인함으로써 관찰될 수 있다. 이 분석법을 수행하는 단순성과 용이성은 미생물학에 노출된 적이 없으며 처음으로 현미경을 통해 미생물을 볼 수있는 사람들을위한 훌륭한 시작 기술입니다.

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References

  1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
  2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
  3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

Transcript

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