Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz
Suelo compone de la capa delgada en la superficie terrestre, que contienen factores bióticos y abióticos que contribuyen a la vida. La porción abiótica incluye partículas inorgánicas de tamaño y forma que determinan la textura del suelo. La parte biótica incorpora residuos de plantas, raíces, materia orgánica y microorganismos. Diversidad y abundancia de microbios del suelo es expansivo, ya que un gramo de suelo contiene 107-8 bacterias, actinomicetos 106-8 , 105-6 hongos, levadura3 10, 104-6 protozoos, algas3-4 10 y 5 nematodos3 . Los factores bióticos y abióticos forman arquitecturas alrededor de raíces de la planta, conocidas como la rizosfera, que proporcionan condiciones favorables para los microorganismos del suelo.
Factores bióticos y abióticos promoción la vida en los suelos. Sin embargo, también contribuyen dinámica estresante que limitan microbios. Estrés biótico implica competencia entre vida para adaptarse y sobrevivir en condiciones ambientales. Por ejemplo, los microbios pueden secretar sustancias inhibidoras o tóxicas para dañar microorganismos vecinos. Penicillium notatum es un hongo notorio, ya que reduce la competencia por nutrimentos mediante la producción de un antimicrobiano, que los seres humanos cosechan para crear la penicilina farmacéutica. Abiótico surge propiedades físicas o químicas, limitando la supervivencia microbiana, tales como luz, humedad, temperatura, pH, nutrientes y textura.
Principles
Observar directamente las interrelaciones entre los organismos del suelo, las partículas y comportamientos en diferentes ambientes del suelo es difícil, pero el análisis del contacto deslizante, también conocido como la técnica del portaobjetos enterrado, desarrollada por Rossi et al. (1936) proporciona un punto de vista de instantáneas en la microbiología del suelo. Este método es útil para la observación de hongos del suelo, actinomicetos y bacterias mediante microscopía. Aunque, no está pensado para cuantificaciones microbianas, ya que sólo implica una pequeña parte de un entorno más heterogéneo.
Este método se realiza fácilmente por enterrar un portaobjetos de cristal en el suelo durante varios días, luego la fijación de los microorganismos en el portaobjetos con ácido acético. Los microbios son teñidos con el colorante Rosa de Bengala y observados mediante microscopia usando inmersión de aceite en el objetivo X 100. Pueden distinguirse tres grupos microbianos como bacterias aparecen como pequeñas formas redondeadas, filamentos de actinomicetos como cuerdas delgadas y hyphae fungicidas como hilos gruesos. En el suelo, casi todas las bacterias son más pequeños y más redondeados que los de cultivo puro debido a estrés nutricional, que provoca contracción y redondeo para una superficie más favorable: cociente del volumen. Las formas oscuras irregulares manchadas no son las partículas del suelo. Pueden añadirse diferentes enmiendas de nutrientes al suelo para proporcionar fuentes de carbono y glucosa que promueven la interacción y crecimiento microbiano. Esta técnica permite la fácil observación de la microbiología del suelo y ayuda a identificar los diversos microorganismos presentes en el medio ambiente.
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Procedure
1. suelo diapositiva microcosmos preparación
- Recoger suelo de jardín de la superficie (0-6 "profundidad), y pesan 150 g suelo en dos tazas separadas.
- Si el suelo tiene alta densidad de la materia orgánica, peso 100 g.
- Una taza de la etiqueta "tratamiento" y el otro "Control".
- Calcular la cantidad de agua necesaria para modificar el contenido de humedad.
- Contenido de humedad está a menudo cerca de capacidad de campo.
- Contenido de humedad está a menudo cerca de capacidad de campo.
- Medir la cantidad de agua destilada con una probeta graduada.
- Vierta la cantidad de agua destilada en dos viales.
- Frasco de etiqueta un "Tratamiento" y el otro "Control".
- Modificar el agua en el frasco de "Tratamiento" con suficiente glucosa a una concentración de glucosa final de suelo de 1%, según una base de peso seco en el suelo de "Tratamiento".
- Agregar 200 mg NH4NO3 en el frasco de "Tratamiento" y revolver para disolver las enmiendas. El nitrato sirve como una fuente de nutrientes para los microbios del suelo.
- No modificar el frasco de "Control".
- En pequeñas alícuotas de 50 mg aproximadamente, mezcle el contenido del frasco de "Tratamiento" en la Copa de "Tratamiento". Revuelva con una espátula después de cada adición de la alícuota.
- En pequeñas alícuotas, mezcle el contenido del frasco de "Control" en la Copa de "Control". Revuelva con una espátula después de cada adición de la alícuota.
- Cuatro portaobjetos limpio de la etiqueta: dos toboganes de "Control" y dos "tratamiento".
- Inserte las dos diapositivas de "Tratamiento" en la Copa "Tratamiento" del suelo e insertar las diapositivas de "Control" dos en la Copa del suelo "Control". Dejar 2 cm de cada diapositiva que proyecta sobre la superficie del suelo y asegúrese de dejar un espacio entre las dos diapositivas.
- Cubrir las copas con el abrigo plástico y asegúrelo con una banda elástica.
- Prefore la envoltura varias veces para permitir que el aire, pero todavía evitar la evaporación excesiva.
- Registrar el peso de ambos vasos.
- Incubar las tazas llenas de suelo a temperatura ambiente en una área designada/incubadora durante 7 días.
2. Deslice la coloración y la microscopia
- Registrar el peso de ambos vasos.
- Calcular la humedad del suelo en el momento de retiro de la diapositiva.
- Retire las dos diapositivas de cada taza pulsando cada diapositiva a una posición inclinada y retirar para que no se disturbe la cara superior de la diapositiva.
- Identifique y marque el lado de la diapositiva teñidas y observadas.
- Golpee suavemente el portaobjetos sobre la mesa para eliminar las partículas de suciedad grandes.
- Limpie con una toalla de papel húmeda la cara inferior de las diapositivas. Seque las diapositivas en temperatura ambiente.
- Usar gafas protectoras y sosteniendo cada diapositiva con pinzas, sumerja los portaobjetos en ácido acético al 40% (v/v) 1-3 minutos bajo una campana de humos.
- Lave el exceso de ácido bajo un chorro suave de agua.
- Utilizando un gotero, cubrir la superficie de los portaobjetos con fenólico de rosa de Bengala. Apoyar la diapositiva sobre una rejilla de tinción sobre un recipiente para recoger el exceso mancha. Ten cuidado, no lave con la fuerza que puede eliminar los microorganismos de la superficie de los portaobjetos.
- Diapositivas de 5-10 min no deje que la corredera se convierten en manchas secas. Añadir más colorante si es necesario.
- Suavemente Lave los portaobjetos para eliminar el exceso de la mancha.
- Deje que los portaobjetos se seca a temperatura ambiente.
- El objetivo de inmersión de aceite, tenga en cuenta la diapositiva utilizando un microscopio (figura 1).
Figura 1. Una diapositiva bajo el microscopio.
Las relaciones entre los distintos organismos y componentes inorgánicos en el suelo son vitales para entender los cambios del suelo y estrés ambiental, pero no pueden ser acladas sin visualización directa.
Suelo, un sistema extremadamente complejo, es el hábitat de millones de diversos organismos. La región de tierra directamente alrededor de las raíces de plantas en particular, llama la rizosfera, contiene una selección única de organismos que están influenciadas directamente por las raíces de la planta.
El componente abiótico, o no-biológicos, de la rizosfera incluye partículas inorgánicas de tamaño y forma que contribuyen a la textura del suelo. La parte biótica o biológica, incluye residuos de plantas, raíces, materia orgánica y microorganismos.
Este video demostrará la visualización directa de los componentes bióticos y abióticos del suelo de la rizosfera, para entender los factores que afectan cambios de suelo y predecir presiones ambientales.
Organismos microscópicos tienden a residir en el agua en los poros del suelo. Las bacterias se encuentran entre los más simples y los organismos más abundantes presentan en el suelo y se encuentran en muchas morfologías incluyendo esferas llamadas cocos, varas llamadas bacilos y las formas filamentosas.
Especies de hongos, levaduras y moldes, son los organismos segundo más abundantes en el suelo. Trabajan para descomponer y reciclar la materia orgánica muerta. Hongos filamentosos microscópicos diferencian visualmente de otros microorganismos, como poseen hifas largas y ramificadas que liberan las esporas.
Observación directa de las relaciones entre estos organismos es difícil, pero puede lograrse utilizando un ensayo de contacto deslizante. Este método se realiza sumergiendo un portaobjetos de cristal en el suelo durante varios días y permitiendo que los organismos y las partículas del suelo adsorben a la superficie del portaobjetos.
La diapositiva entonces se quita en un ángulo para evitar manchas de la superficie. Los microbios son fijos con ácido acético y teñidos con tinción de rosa de Bengala para permitir la visualización mediante microscopía óptica.
Ahora que usted entiende los principios de la técnica de ensayo de contacto deslizante, permite echar un vistazo al proceso en el laboratorio.
En primer lugar, recoger la superficie del suelo jardín y transfiera el suelo en el laboratorio. Pesar 150 g de suelo en los 2 recipientes separados. Un envase debe etiquetarse como la muestra de tratamiento, que se modificará con nutrientes para estimular la rápida proliferación de microorganismos. Etiqueta de la otra como control, que será invariable.
Calcular el contenido de agua en el suelo, utilizando la técnica que se muestra en determinación del contenido de esta colección de humedad en el suelo video. Basado en este cálculo, determinar la cantidad de agua en el suelo sobre una base de peso seco. Calcular la cantidad de agua que debe añadirse para dar un contenido de humedad 15%. Esto lleva la humedad a capacidad de campo, óptima para el crecimiento de microorganismos.
Medir la cantidad calculada de agua destilada con una probeta graduada. Verter el volumen calculado de agua en cada recipiente. Basado en el peso seco previamente determinado del suelo, calcule la cantidad de glucosa necesaria para alcanzar una concentración de glucosa final de suelo de 1% en masa, utilizando la base de peso seco. Pesar esta cantidad de glucosa y añadir al contenedor de tratamiento solamente.
Pesar 200 mg de nitrato de amonio, luego añadir al contenedor de tratamiento solamente. El nitrato de amonio sirve como fuente de nutrientes nitrogenada para los microbios del suelo. Mezclar la mezcla de suelo, la glucosa y el nitrato de amonio en el envase.
A continuación, la etiqueta 4 portaobjetos limpio: dos como tratamiento y dos como control. Inserte las diapositivas de dos tratamientos en el envase del suelo tratamiento. Dejar una sección de cada diapositiva expuesta sobre la superficie del suelo y asegurar que existe una brecha entre las dos diapositivas.
Inserte las diapositivas de dos control en el envase del suelo control de la misma manera. Cubrir las copas con envoltura de plástico y asegúrelo con una banda de caucho. Perfore la envoltura de plástico varias veces para permitir a transferencia de aire, pero todavía evitar la evaporación excesiva.
Finalmente, pesar ambas tazas, registrar su peso y les Incube en un área designada a temperatura ambiente durante siete días.
Después de la incubación de siete días, calcular el contenido de humedad de suelo pesando las tazas de suelo. Determinar si el peso se ha perdido debido a la evaporación de agua y reemplace el agua si es necesario.
Retire el plástico del envase y retire las dos diapositivas del suelo pulsando cada diapositiva a una posición inclinada, y retirar para que la cara superior de la diapositiva es imperturbada.
Golpee suavemente el portaobjetos para eliminar partículas grandes del suelo. Limpie con una toalla de papel húmeda la cara inferior de las diapositivas. Déjelos secar a temperatura ambiente en una campana de humos. Una vez seco, recoger un portaobjetos con unas pinzas y sumergir en ácido acético en 1 a 3 min.
Enjuague la parte superior de la diapositiva con un chorro suave de agua destilada para eliminar el exceso de ácido. Repita estos pasos para todas las diapositivas. Deje que los portaobjetos al aire seco.
Apoye la diapositiva sobre una parrilla de tinción en un recipiente para recoger el exceso de tinte. Suavemente utilizando un gotero, cubrir la superficie de cada diapositiva con colorante Rosa de Bengala fenólico. Deje que los portaobjetos a la mancha de 5 a 10 minutos, teniendo cuidado de agregar más colorante según sea necesario para mantener las diapositivas mojadas. Suavemente enjuague los portaobjetos con agua para eliminar el tinte sobrante y deje que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente.
Examinar los portaobjetos en un microscopio de luz, usando un objetivo de inmersión de aceite. El suelo tratado tendrá más microbios del suelo.
Las interacciones espaciales entre organismos hongos y bacterias en las muestras de suelo típica pueden visualizarse fácilmente. Las partículas del suelo mostrar formas irregulares oscuras.
Organismos fúngicos muestran gruesas hifas filamentosas y actinomycetes muestran hifas filamentosas delgadas.
Se encuentran bacterias como cocos pequeños o formas de varilla, normalmente en grupos, en las partículas del suelo o revestimiento de hifas de los hongos.
El aislamiento directo de los organismos del suelo es importante para la comprensión de las características de suelo y medio ambiente.
Nematodos entomopatógenos son microscópicas alrededor de gusanos que parasitan insectos. Mientras que no se visualizan en el análisis del contacto deslizante, pueden ser aislados de las muestras de suelo recogidas, como se muestra en este ejemplo.
En primer lugar, se ceban los nematodos en el suelo usando insectos identificadas por examen visual. Nematodos fueron aislados del cebo muerto insecto, colocar los insectos muertos en un ambiente húmedo y oscuro y permitiendo que los nematodos a migrar hacia fuera en el agua circundante. Los nematodos fueron recogidos del agua y analizados.
Hongos filamentosos son vitales para la salud del suelo debido a su papel en el reciclaje de nutrientes. En este ejemplo se realizó el aislamiento y observación de hongos filamentosos del suelo.
Las muestras de suelo fueron diluidas con agua y agregadas para separar estériles placas de agar rosa Bengala estreptomicina. La estreptomicina prevenir crecimiento bacteriano y permitió el crecimiento del hongo. Colonias fúngicas eran contadas y montadas en un portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva. Los hongos fueron luego fotografiados utilizando un microscopio de luz.
Microorganismos del suelo descomponen naturalmente componentes en el suelo, tales como organismos y plantas muertas. Biodegradación y la colonización de películas plásticas biodegradables fue examinado, como se muestra en este ejemplo.
Hongos fueron aislados de películas de plástico enterradas en el suelo durante varios meses. Los hongos entonces fueron probados individualmente para el crecimiento de películas de plástico. Películas de plástico entonces se incubaron con la cepa de hongos seleccionada con ningún medio de crecimiento, para observar la degradación directa de la plástica por los hongos.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para el ensayo de contacto deslizante para la proyección de imagen cualitativa de microbios del suelo. Ahora debería entender cómo preparar el contacto deslizante y visualizar los microbios del suelo. ¡Gracias por ver!
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Results
Hongos muestran hifas gruesas, filamentosos (figura 2). Actinomycetes muestran hifas delgadas, filamentosos. Bacteria muestra cocos pequeños o formas de barra. A menudo es encontrados en macizos, en las partículas del suelo o revestimiento de hifas de los hongos. Las partículas del suelo mostrar formas irregulares, oscuros (figura 3).
Figura 2. Imagen de diapositiva contacto con objetivo de 100 X.
Foto cortesía de W.H. de Fuller.
Figura 3. Imagen de diapositiva contacto con objetivo de 100 X.
Foto cortesía de W.H. de Fuller.
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Applications and Summary
El ensayo de contacto deslizante, también conocido como el portaobjetos enterrado, es una técnica simple utilizada para observar cualitativamente la biota del suelo. Este análisis cualitativo muestran las interacciones espaciales entre hifas de los hongos, filamentos actinomycete, las bacterias y las partículas del suelo. Individuos o la industria puede emplear este análisis para recopilar conocimientos sobre la salud de un suelo particular en lo que respecta a la agricultura, jardinería, compostaje, enseñar y estudiar. Sin embargo, esta técnica no cuantificar biota micro del suelo, ya que sólo abarca un pequeño retrato de un entorno más heterogéneo.
Relaciones de organismo de suelo pueden ser observadas por la realización del análisis de contacto deslizante y visualización de los resultados a través de microscopía de inmersión de aceite de 100 X (figuras 2 y 3). La simplicidad y la facilidad para realizar este análisis es una gran técnica partida para aquellos que nunca han sido expuestos a la microbiología y por primera vez se puede ver microorganismos a través de un microscopio.
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References
- Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
- Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
- Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).
