Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

הדמיית מיקרואורגניזמים קרקע באמצעות מצג שקופיות מגע ומיקרוסקופיה
 
Click here for the English version

הדמיית מיקרואורגניזמים קרקע באמצעות מצג שקופיות מגע ומיקרוסקופיה

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ

האדמה כוללת את השכבה הדקה על פני כדור הארץ, המכילה גורמים ביוטיים ואביוטיים התורמים לחיים. החלק האביוטי כולל חלקיקים אנאורגניים הנעים בגודלם ובצורתם הקובעים את מרקם הקרקע. החלק הביוטי משלב שאריות צמחים, שורשים, חומר אורגני ומיקרואורגניזמים. שפע חיידקי הקרקע ומגוון הוא נרחב, כמו גרם אחד של אדמה מכיל 107-8 חיידקים, 106-8 actinomycetes, 105-6 פטריות, 103 שמרים, 104-6 פרוטוזואה, 103-4 אצות, ו 53 נמטודות. יחד, הגורמים הביוטיים והאביוטיים יוצרים ארכיטקטורות סביב שורשי הצמח, המכונה הריזוספירה, המספקות תנאים נוחים למיקרואורגניזמים בקרקע.

גורמים ביוטיים ואביוטיים מקדמים את החיים בקרקעות. עם זאת, הם גם תורמים דינמיקה מלחיצה המגבילה חיידקים. מתח ביוטי כרוך בתחרות בין החיים כדי להסתגל ולשרוד בתנאים סביבתיים. לדוגמה, חיידקים יכולים להפריש חומרים מעכבים או רעילים כדי לפגוע במיקרואורגניזמים שכנים. פניציליום נוטטום הוא פטרייה ידועה לשמצה, כפי שהוא מפחית את התחרות על חומרים מזינים על ידי ייצור מיקרוביאלית, אשר בני אדם לקצור כדי ליצור פניצילין התרופות. לחצים אביוטיים נובעים ממאפיינים פיזיים או כימיים המגבילים את ההישרדות המיקרוביאלית, כגון אור, לחות, טמפרטורה, pH, חומרים מזינים ומרקם.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התבוננות ישירה בקשרי הגומלין בין אורגניזמים, חלקיקים והתנהגויות בקרקע בסביבות קרקע שונות היא קשה, אך בדיקת שקופיות המגע, הידועה גם כניקת הגלישה הקבורה, שפותחה על ידי רוסי ואח ' (1936) מספקת נקודת מבט למיקרוביולוגיה של הקרקע. שיטה זו שימושית לצפייה בפטריות קרקע, אקטינומיצטים וחיידקים באמצעות מיקרוסקופיה. אמנם, זה לא מיועד לכימותים מיקרוביאליים, כפי שהוא מרמז רק חלק קטן אחד של סביבה הטרוגנית גדולה יותר.

שיטה זו מבוצעת בקלות על ידי קבורת שקופית זכוכית לתוך האדמה במשך מספר ימים, ולאחר מכן תיקון המיקרואורגניזמים על השקופית עם חומצה אצטית. החיידקים מוכתמים בצבע רוז בנגלי ונצפתם באמצעות מיקרוסקופיה באמצעות טבילת שמן במטרה 100X. ניתן להבחין בין שלוש קבוצות מיקרוביאליות, שכן חיידקים מופיעים כצורות מעוגלות קטנות, חוטי אקטינומיצ'ט כחוטות דקות, והייפ פטרייתי כחוטים עבים. בקרקע, כמעט כל החיידקים קטנים ועגולים יותר מאלה בתרבות הטהורה בשל מתח תזונתי, מה שגורם להתכווצות ועיגול למשטח נוח יותר: יחס נפח. הצורות הכהות הלא סדירות שאינן מוכתמות הן חלקיקי אדמה. ניתן להוסיף תיקונים תזונתיים שונים לקרקע כדי לספק מקורות פחמן וגלוקוז המקדמים צמיחה מיקרוביאלית ואינטראקציות. טכניקה זו מאפשרת תצפית קלה על מיקרוביולוגיה הקרקע ומסייעת לזהות מספר אורגניזמים הקיימים בסביבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת מיקרוקוסמוס של שקופית הקרקע

  1. אוספים אדמת גן מפני השטח (עומק 0-6 אינץ'), ומשקלים 150 גרם אדמה לשתי כוסות נפרדות.
    1. אם לקרקע יש צפיפות גבוהה של חומר אורגני, שקול 100 גרם.
  2. תייג אחת טיפול והשני בקרה.
  3. חשב את כמות המים הדרושה לשינוי תכולת הלחות.
    1. תכולת הלחות קרובה לעתים קרובות לקיבולת השדה.
      Equation 1 1
  4. למדוד כמות של מים מזוקקים עם גליל מדורג.
  5. יוצקים כמות מים מזוקקים לשני בקבוקונים.
  6. תייגו את ה"טיפול" ובאחר "בקרה".
  7. לתקן את המים במתקנה "טיפול" עם מספיק גלוקוז עבור ריכוז גלוקוז הקרקע הסופי של 1%, על בסיס משקל יבש בקרקע "טיפול".
  8. מוסיפים 200 מ"ג NH4NO3 לחקירה "טיפול" ומערבבים כדי להמיס את התיקונים. החנקות משמשות כמקור חנקן של חומרים מזינים עבור חיידקי הקרקע.
  9. אל תתקן את ממתקנת ה"בקרה".
  10. ב aliquots קטן של כ 50 מג, לערבב את התוכן של טיפול ביקאלי לתוך טיפול. מערבבים עם מרית לאחר כל תוספת עליקוט.
  11. ב aliquots קטן, לערבב את התוכן של בקרה בקוקאלי לתוך שליטה. מערבבים עם מרית לאחר כל תוספת עליקוט.
  12. תווית ארבע שקופיות מיקרוסקופ נקיות: שתי שקופיות "טיפול" ושתי שקופיות "בקרה".
  13. הכנס את שתי שקופיות טיפול לתוך הקרקע טיפול, ולהכניס את שתי שקופיות בקרה לתוך הקרקע שליטה. השאר 2 ס"מ מכל שקופית המוקרנת מעל פני הקרקע, והקפידו להשאיר רווח בין שתי השקופיות.
  14. מכסים את הכוסות בניילון נצמד ומאבטחים אותה בגומייה.
  15. לנקב את העטיפה מספר פעמים כדי לאפשר אוויר, אבל עדיין למנוע אידוי מוגזם.
  16. תקליט את המשקל של שתי הכוסות.
  17. לדגור על הכוסות מלאות הקרקע בטמפרטורת החדר באזור / אינקובטור ייעודי במשך 7 ימים.

2. כתמי שקופיות ומיקרוסקופיה

  1. תקליט את המשקל של שתי הכוסות.
  2. חשב את לחות הקרקע בזמן הסרת שקופיות.
  3. הסר את שתי השקופיות מכל על-ידי הקשה על כל שקופית למיקום נוטה ונסיגה כך שהפנים העליונות של השקופית לא יפריעו.
  4. זהה וסמן את צד השקופית כך שיוכתם ויתבונן.
  5. הקש בעדינות על השקופיות על הספסל העליון כדי להסיר חלקיקי קרקע גדולים.
  6. בעזרת מגבת נייר לחה, נקו את הפנים התחתונות של המגלשות. יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר.
  7. מרכיב משקפי מגן ומחזיק כל מגלשה במלקחיים, טובל את השקופיות בחומצה אצטית של 40% (v/v) למשך 1-3 דקות מתחת למכסה המנוע.
  8. לשטוף את החומצה עודפת תחת זרם עדין של מים.
  9. באמצעות בקבוק טפטפת, לכסות את פני השטח של השקופיות עם רוז בנגל פנולי. תמוך בשקופית על מתלה כתמים מעל מיכל כדי לתפוס את הכתם העודף. היזהר, לא לשטוף בכוח שעלול להסיר מיקרואורגניזמים מפני השטח של השקופיות.
  10. מכתימים את השקופיות למשך 5-10 דקות. אל תתנו למגלשה להתייבש. מוסיפים עוד כתם לפי הצורך.
  11. יש לשטוף בעדינות את השקופיות כדי להסיר כתם עודף.
  12. תן לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר.
  13. בעזרת המטרה טבילת שמן, התבונן בשקופית באמצעות מיקרוסקופ (איור 1).

Figure 1
איור 1. שקופית מתחת למיקרוסקופ.

היחסים בין האורגניזמים השונים לבין הרכיבים הלא אורגניים בקרקע חיוניים להבנת שינויים בקרקע ובלחצים סביבתיים, אך לא ניתן לפרטם ללא הדמיה ישירה.

אדמה, מערכת מורכבת ביותר, היא בית גידול למיליוני אורגניזמים מגוונים. אזור האדמה היישר סביב שורשי הצמח בפרט, הנקרא ריזוספירה, מכיל מערך ייחודי של אורגניזמים המושפעים ישירות משורשי הצמח.

הרכיב האביוטי, או הלא ביולוגי, של הריזוספירה כולל חלקיקים אנאורגניים הנעים בגודלם ובצורתם התורמים למרקם האדמה. החלק הביוטי, או הביולוגי, כולל שאריות צמחים, שורשים, חומר אורגני ומיקרואורגניזמים.

וידאו זה ידגים הדמיה ישירה של הרכיבים הביוטיים והאביוטיים של אדמת הריזוספירה, על מנת להבין גורמים המשפיעים על שינויים בקרקע ולחזות לחצים סביבתיים.

אורגניזמים מיקרוסקופיים נוטים להתגורר במים הממוקמים בתוך נקבוביות הקרקע. חיידקים הם בין האורגניזמים הפשוטים והשופעים ביותר הקיימים בקרקע, ונמצאים במורפולוגיות רבות, כולל כדורים הנקראים קוצ'י, מוטות הנקראים בצילי וצורות חוטיות.

מינים פטרייתיים, כגון שמרים ותבניות, הם האורגניזמים השניים הנפוצים ביותר באדמה. הם פועלים כדי לפרק ולמיחזור חומר אורגני מת. פטריות חוטים מיקרוסקופיות שונות חזותית ממיקרואורגניזמים אחרים, שכן יש להן הייהה ארוכה וסועפת המשחררת נבגים.

התבוננות ישירה ביחסים בין אורגניזמים אלה היא מאתגרת, אך ניתן להשיג אותה באמצעות מבחנת שקופיות מגע. שיטה זו מבוצעת על ידי טביעת מגלשת זכוכית לתוך האדמה במשך מספר ימים ומאפשרת לאורגניזמים ולחלקיקי הקרקע לספג על פני השטח של השקופית.

לאחר מכן, השקופית מוסרת בזווית כדי למנוע מריחה של המשטח. החיידקים קבועים בחומצה אצטית, ומוכתמים בכתם רוז בנגלי כדי לאפשר הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קלה.

עכשיו שאתה מבין את העקרונות מאחורי טכניקת בדיקת שקופיות מגע, בואו נסתכל על התהליך במעבדה.

ראשית, לאסוף אדמת גן פני השטח ולהעביר את הקרקע לתוך המעבדה. שוקלים 150 גרם אדמה לתוך 2 מיכלים נפרדים. מיכל אחד צריך להיות מתויג כדגימת הטיפול, אשר ישתנה עם חומרים מזינים כדי לעודד התפשטות מהירה של אורגניזמים. תייג את השני כפקד, שלא ישתנה.

חשב את תכולת המים בקרקע, באמצעות הטכניקה המוצגת בסרטון קביעת הלחות של אוסף זה בסרטון אדמה. בהתבסס על חישוב זה, לקבוע את כמות המים בקרקע על בסיס משקל יבש. עכשיו לחשב את כמות המים שיש להוסיף כדי לתת 15% תוכן לחות הקרקע. זה מביא את הלחות לקיבולת השדה, אופטימלי לצמיחת מיקרואורגניזם.

מדוד את הכמות המחושבת של מים מזוקקים באמצעות גליל מדורג. יוצקים את נפח המים המחושב לכל מיכל. בהתבסס על המשקל היבש שנקבע בעבר של הקרקע, לחשב את כמות הגלוקוז הדרוש כדי להשיג ריכוז גלוקוז הקרקע הסופי של 1% על ידי מסה, באמצעות בסיס משקל יבש. שקול כמות זו של גלוקוז ולהוסיף אותו למיכל הטיפול בלבד.

שוקלים 200 מ"ג אמוניום חנקתי, ואז מוסיפים אותו למיכל הטיפול בלבד. האמוניום החנקתי משמש כמקור התזונתי החנקני של חיידקי הקרקע. מערבבים את האדמה, הגלוקוז והתערובת אמוניום חנקתי במיכל.

לאחר מכן, תווית 4 שקופיות מיקרוסקופ נקי: שתיים כטיפול, ושתיים כשליטה. הכנס את שתי שקופיות הטיפול לתוך מיכל הקרקע הטיפול. השאר קטע של כל שקופית חשוף מעל פני הקרקע, וודא שיש רווח בין שתי השקופיות.

הכנס את שתי שקופיות הפקד למיכל הקרקע של הפקד באותו אופן. מכסים את הכוסות בניילון נצמד, ומאובטחים בגומייה. לנקב את ניילון נצמד מספר פעמים כדי לאפשר העברה אווירית, אבל עדיין למנוע אידוי מוגזם.

לבסוף, שקול את שתי הכוסות, תיעד את משקלן ודגר אותן באזור ייעודי בטמפרטורת החדר במשך שבעה ימים.

לאחר הדגירה בת שבעת הימים, לחשב את תכולת הלחות הקרקע על ידי שקילה כוסות הקרקע. קבע אם משקל אבד עקב אידוי מים, והחלף את המים במידת הצורך.

הסר את ניילון נצמד מן המיכל, ולהסיר את שתי השקופיות מהאדמה על ידי לחיצה על כל שקופית למיקום נוטה, ונסוג כך הפנים העליונות של השקופית הוא ללא הפרעה.

הקש בעדינות על השקופיות כדי להסיר חלקיקי אדמה גדולים. בעזרת מגבת נייר לחה, נקו את הפנים התחתונות של המגלשות. אפשר להם להתייבש בטמפרטורת החדר במכסה אדים. לאחר יבש, להרים שקופית עם מלקחיים, לטבול אותו לתוך חומצה אצטית במשך 1 עד 3 דקות.

לשטוף את החלק העליון של המגלשה עם זרם עדין של מים מזוקקים כדי להסיר חומצה עודפת. חזור על שלבים אלה עבור כל השקופיות. אפשר לשקופיות להתייבש באוויר.

תמוך בשקופית על מתלה כתמים מעל מיכל כדי לתפוס צבע עודף. באמצעות טפטפת, לכסות בעדינות את פני השטח של כל שקופית עם צבע רוז בנגלי פנולי. אפשר לשקופיות להכתים במשך 5 עד 10 דקות, תוך שמירה על הוספת צבע נוסף לפי הצורך כדי לשמור על המגלשות רטובות. יש לשטוף בעדינות את המגלשות במים כדי להסיר כתם עודף, ולאפשר לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר.

בדוק את השקופיות על מיקרוסקופ אור, באמצעות מטרה טבילת שמן. באדמה המטופלת יהיו יותר חיידקי קרקע.

ניתן לדמיין בקלות את האינטראקציות המרחביות בין אורגניזמים פטרייתיים וחיידקיים בדגימות קרקע טיפוסיות. חלקיקי קרקע מציגים צורות לא סדירות כהות.

אורגניזמים פטרייתיים מציגים הייהה עבה, בעוד שאקטינומייצטים מציגים הידה דקה.

חיידקים נמצאים כצורות קוצ'י או מוט קטנות, בדרך כלל בגושים, על חלקיקי קרקע או הייפ פטרייתי בטנה.

בידוד ישיר של אורגניזמים מהאדמה חשוב להבנת מאפייני הקרקע והסביבה.

נמטודות אנטומופתוגניות הן תולעים עגולות מיקרוסקופיות המטמירות חרקים. למרות שהם אינם דמיינו את מבזק שקופית המגע, ניתן לבודד אותם מדגימות קרקע שנאספו, כפי שמוצג בדוגמה זו.

ראשית, הנמטודות היו פיתיון באדמה באמצעות חרקים שזוהו מבדיקה חזותית. נמטודות היו מבודדות מפיתיון החרקים המתים, על ידי הצבת החרקים המתים בסביבה לחה וחשוכה ואפשרו לנמטודות לנדוד אל המים שמסביב. לאחר מכן נאספו הנמטודות מהמים ונותחו.

פטריות חוטיות חיוניות לבריאות הקרקע בשל תפקידן במיחזור חומרים מזינים. בידוד והתבוננות בפטריות חוטיות מהאדמה נערכו בדוגמה זו.

דגימות הקרקע היו מדוללות במים, ונוספו לצלחות אגר סטריליות סטריליות של רוז בנגל. הסטרפטומיצין מנע צמיחה חיידקית, ואיפשר צמיחה פטרייתית. מושבות פטרייתיות נספרו והורכבו על מגלשת זכוכית באמצעות סרט הדבקה. הפטריות צולמו אז באמצעות מיקרוסקופ אור.

מיקרואורגניזמים של הקרקע מפרקים באופן טבעי רכיבים בקרקע, כגון צמחים מתים ואורגניזמים. מתכלה והתיישבות של סרטי פלסטיק מתכלים נבדקו, כפי שמוצג בדוגמה זו.

פטריות היו מבודדות מסרטי פלסטיק שנקברו באדמה במשך מספר חודשים. הפטריות נבדקו אז בנפרד לצמיחה בסרטי פלסטיק. סרטי פלסטיק דוגר אז עם זן פטרייתי נבחר ללא מדיה צמיחה, על מנת לראות השפלה ישירה של הפלסטיק על ידי הפטריות.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לבדיקת שקופיות המגע להדמיה איכותית של חיידקי קרקע. עכשיו אתה צריך להבין איך להכין את שקופית המגע, ולדמיין חיידקי קרקע. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פטריות מציגות הייהה עבה, חוטית(איור 2). Actinomycetes להציג hyphae דק, filamentous. חיידקים מציגים צורות קטנות של קוצ'י או מוט. הם נמצאים לעתים קרובות בגושים, על חלקיקי אדמה, או רירית hyphae פטרייתי. חלקיקי קרקע מציגים צורות כהות ולא סדירות(איור 3).

Figure 2
איור 2. תמונת שקופית מגע באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X.
התמונה באדיבות ו.ה. פולר.

Figure 3
איור 3. תמונת שקופית מגע באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X.
התמונה באדיבות ו.ה. פולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בדיקת שקופיות המגע, המכונה גם שקופית קבורה, היא טכניקה פשוטה המשמשת להתבוננות איכותית בביוטה הקרקע. בדיקת אסקור זו מראה באופן איכותי את האינטראקציות המרחביות בין hyphae פטרייתי, חוטי actinomycete, חיידקים, וחלקיקי קרקע. יחידים או תעשייה יכולים להשתמש בבחינה זו כדי לאסוף ידע על בריאות האדמה הספציפית בכל הנוגע לחקלאות, גינון, קומפוסט, הוראה ולימוד. עם זאת, טכניקה זו אינה לכמת את ביוטה מיקרו הקרקע, כפי שהוא מקיף רק דיוקן קטן של סביבה הטרוגנית גדולה יותר.

ניתן להבחין ביחסי אורגניזם קרקע על ידי ביצוע בדיקות שקופיות מגע וצפייה בתוצאות באמצעות מיקרוסקופיה טבילת שמן 100X(איורים 2 ו -3). הפשטות והקלות בביצוע בדיקת ההסתה הזו הופכת אותה לטכניקת התחלה נהדרת עבור אלה שמעולם לא נחשפו למיקרוביולוגיה ועשויים לצפות במיקרואורגניזמים דרך מיקרוסקופ בפעם הראשונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
  2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
  3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter