Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

זיהוי מיקרואורגניזמים סביבתיים עם תגובת שרשרת פולימראז ואלקטרופורזה ג'ל
 
Click here for the English version

זיהוי מיקרואורגניזמים סביבתיים עם תגובת שרשרת פולימראז ואלקטרופורזה ג'ל

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס ג'רבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה המשמשת לזיהוי מיקרואורגניזמים הנמצאים בקרקע, במים ובסביבות אטמוספריות. על ידיגברת מקטעים ספציפיים של DNA, PCR יכול להקל על זיהוי וזיהוי של מיקרואורגניזמים היעד עד למין, זן, ורמת serovar / pathovar. ניתן להשתמש בטכניקה גם כדי לאפיין קהילות שלמות של מיקרואורגניזמים בדגימות.

פולחן המיקרואורגניזמים במעבדה באמצעות מדיית צמיחה מיוחדת הוא טכניקה ותיקה ונשאר בשימוש לגילוי מיקרואורגניזמים בדגימות סביבתיות. חיידקים רבים בסביבה הטבעית, בעודם בחיים, שומרים על רמות נמוכות של פעילות מטבולית ו/או זמני הכפלה ולכן מכונים אורגניזמים בני קיימא אך לא פולחניים (VBNC). השימוש בטכניקות מבוססות תרבות בלבד אינו יכול לזהות חיידקים אלה, ולכן אינו מספק הערכה יסודית של אוכלוסיות מיקרוביאליות בדגימות. השימוש ב- PCR מאפשר זיהוי של חיידקים הניתנים לתנור, אורגניזמים VBNC ואלה שאינם חיים או פעילים עוד, שכן הגברה של רצפים גנטיים אינה דורשת בדרך כלל העשרה מוקדמת של מיקרואורגניזמים הקיימים בדגימות סביבתיות. עם זאת, PCR אינו יכול להבדיל בין המצבים הנ"ל של כדאיות ופעילות. בשילוב עם טכניקה אחת או יותר המבוססת על תרבות, הכדאיות של תת-קבוצות מסוימות של מיקרואורגניזמים עדיין עשויה להיקבע.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הנחת היסוד של PCR היא להשתמש במחזורים חוזרים ונשנים של שינויי טמפרטורה רציפים כדי להשיג הגברה מעריכית של DNA. סינתזת הדנ"א מתבצעת על ידי אנזימי פולימראז DNA המתקבלים מחיידקים החיים במעיינות חמים, כגון תרמיוס אקווטיקה (Taq). פולימראזים אלה הם חום יציב, המאפשר להם לעמוד בטמפרטורות הגבוהות המשמשות במהלך PCR.

רצף היעד, המכונה אמפליסון, מוגבר מתבנית ה- DNA באמצעות שתי רצועות קצרות של נוקלאוטידים המכונים "פריימרים". בגלל הספציפיות הגבוהה של כריכת חומצת גרעין משלימה, הפריימרים מאפשרים הגברה ממוקדת של רצפים ספציפיים מאוד של עניין. על ידי עיצוב פריימרים שרק יגבירו רצף ייחודי (או שילוב ייחודי של רצפים) מאורגניזם מעניין, ניתן להשתמש ב- PCR כדי לזהות באופן דיפרנציאלי את נוכחות הדנ"א של האורגניזם בין כל החומרים הגנטיים הקיימים במדגם סביבתי מורכב.

כדי לבצע PCR, מכונה המכונה thermocycler משמש מחזור אוטומטי דרך הטמפרטורות השונות הנדרשות עבור התגובה. כל מחזור מחולק לשלושה שלבים. הראשון, המכונה "denaturation", מוגדר בדרך כלל מעל 92 °C (70 °F) ונמשך כ -30 מעלות צלזיוס. דנטורציה משמשת לפירוק מולקולות DNA לגדילים בודדים, כדי לאפשר לתגובת ההגברה להמשיך.

השלב השני, "חישול", מוגדר 2-3 °C (5 °F) מתחת לטמפרטורת ההיתוך של שני פריימרים, בדרך כלל בין 50-65 °C (50 °F), וגם נמשך כ -30 מעלות צלזיוס. טמפרטורת ההיתוך היא הטמפרטורה שבה 50% מהדנ"א הכפול נפרדו לגדילים בודדים, ולכן שלב ההמסה מאפשר לפריימרים להיקשר לאתרי היעד שלהם בתבנית הדנ"א.

השלב השלישי של מחזור PCR הוא "התארכות" או "הרחבה", כאשר פולימראז ה- DNA נקשר לדופלקס תבנית פריימר ומזרז סינתזה של המוצר. מוגדר על 72 °C עבור פולימראז טאק, משך שלב זה תלוי באורך של אמפליסון, בדרך כלל 30 s / 500 bp. לאחר כל מחזור, ה- DNA המוגבר שוב מושמצת ומשמש כתבנית חדשה, מה שמוביל לעלייה מעריכית בכמות מוצרי ה- PCR.

לאחר השלמת התגובה, ניתן לפתור את מוצרי ה- PCR לפי גודל על "ג'ל" העשוי בדרך כלל אגרוז פולימר, תהליך המכונה אלקטרופורזה. שדה חשמלי מוחל על פני הג'ל, והמטענים השליליים בעמוד השדרה של מולקולות ה- DNA גורמים להם לנדוד לעבר הקצה החיובי של השדה. באופן כללי, מולקולות DNA ליניאריות גדולות יותר ייקח יותר זמן לנסוע דרך מטריצת הג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. איסוף דוגמאות

  1. לאסוף אדמה באמצעות אוגר או את חפירה עד לעומק נחוש. אם אוספים אדמה מהקרניזון (האזור הצר של האדמה המקיפה ומושפעת משורשי הצמח והמיקרואורגניזמים הקשורים אליהן), אוספים ישירות מסביב לשורשים הצמחיים רק על ידי פגיעה בקרקע לחבית איסוף.
  2. לאסוף דגימת מים על ידי טבילת בקבוק פלסטיק סטרילי לתוך המים תוך החזקת הקצה של מקל הטבילה.

2. מיצוי והכנה של חומצות גרעין

  1. לאסוף אורגניזמים ווירוסים מהדגימה, ולחלץ דנ"א ורנ"א מהם. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי JoVE על מיצוי חומצת גרעין קהילתית.
  2. אחסן את הדנ"א שחולץ בצינורות מיקרופוגה מסומנים. אם ה- DNA צריך להיות מאוחסן בלילה או לתקופות זמן ארוכות יותר, להקפיא אותו ב -20 °C (70 °F), ולהפשיר את הצינורות בטמפרטורת החדר כאשר מוכן לשימוש.
  3. אם החומר הגנטי שיש להתבצע הוא RNA (בין אם זה הגנום של וירוסי RNA, או ה- RNA המתומלל של אורגניזמים תאיים), בצע שעתוק הפוך (RT) על המדגם כדי ליצור DNA משלים (cDNA) לפני שתמשיך ל- PCR. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי של JoVE ב- RT-PCR.

3. תגובת שרשרת פולימראז

  1. מניחים את האנזים PCR(למשל, טאק פולימראז) על קרח ומפשירים את ריאגנטים אחרים (חיץ PCR, dNTPs, פריימרים) בתוך מכסה המנוע "נקי" המיועד בטמפרטורת החדר. האנזים מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס אך לעולם אינו קופא. הוא רגיש לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על קור רוח ועל חשיפתו לטמפרטורת הסביבה ממוזערת
  2. חשב את הנפח של כל ריאגנט הדרוש כדי ליצור "תערובת ראשית" של כל הריאגנטים הקבועים בין כל התגובות (טבלה 1). הקפד להסביר פקדים חיוביים(לדוגמה,תבנית הידועה כמכילה את אזור היעד) ושלילי(לדוגמה,ללא תבנית) בחישובים. הוסף 10% נוספים לאמצעי האחסון הסופי כדי להסביר שגיאת צנרת. כרכים פריימר תלויים בדיקות עבור אורגניזמים ספציפיים; עיין בספרות שפורסמה עבור הערכים המתאימים.
  3. באמצעות צינור מיקרו-קשירה נמוך, הממזער את ההידבקות של מולקולות ריאגנט לקירות הפלסטיק, מוסיפים את הנפחים המחושבים של כל ריאגנט כדי להרכיב את תערובת האב. מערבולת בעדינות וצנטריפוגות כל ריאגנט לפני הוספת. לאחר תערובת המאסטר מוכן, מערבולת לערבב ולאסוף על ידי צנטריפוגה
  4. הכן רצועות PCR 8-tube. ייעד צינור לכל דגימה, כולל פקדים חיוביים ושליליים
  5. מחלקים את הנפח המתאים של תערובת PCR לכל שפופרת של הרצועה
  6. הוסף את הנפח המתאים של תבנית DNA מן הדגימות, כמו גם 5 μL של התבנית החיובית ו 5 μL של מים כיתה מולקולרית כמו שליטה שלילית, לתוך צינורות PCR בהתאמה.
  7. מניחים את המכסה בבטחה על רצועת 8 הצינורות וצנטריפוגה למשך מספר שניות באמצעות מיני צנטריפוגה
  8. מניחים את רצועת 8 הצינורות בתרמוסקלר
  9. הגדר את תוכנית ה- PCR המתאימה לפעול על התרמו-מחזור. תוכנית טיפוסית מורכבת מהפעולות הבאות
    1. דנטורציה ב 94 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
    2. 30-40 מחזורים של הגברה: denaturation ב 94 °C (30 °F) עבור 30 s, חישול בטמפרטורה ספציפית פריימר (בדרך כלל בין 50-60 °C (50 °F) עבור 30 °C (30 °F), והרחבה ב 72 °C (72 °F) עבור 30 ° C / 500 bp.
    3. הארכה סופית ב 72 °C (7-10 דקות).

4. הכנת ג'ל אגרוז

  1. בהתבסס על נפח הג'ל הרצוי וריכוז הג'ל (טבלה 2), לשקול את הכמות המתאימה של אבקת אגרוז לתוך בקבוק ארלנמאייר 125 מ"ל.
  2. מוסיפים את הנפח המתאים של מאגר ג'ל לבקבוקון, ומערבבים את הבקבוק ביד.
  3. מחממים את תערובת האגרוז במיקרוגל בעוצמה גבוהה במשך דקה אחת.
  4. מוציאים את הבקבוקון מהמיקרוגל ומערבבים ביד כדי לוודא שכל האגרוז נמס. אם האגרוז לא נמס לחלוטין, מיקרוגל חוזר במרווחים של 30-s.
  5. לאחר אבטחה הדוקה של המכסה על הבקבוקון, לקרר אותו ל 50 °C (50 °F) על ידי סיבוב תחת מים קרים זורמים.
  6. הוסף 1 μL של אתידיום ברומיד (EtBr) לתערובת אגרוז באמצעות מיקרופיפט המיועד EtBr. EtBr הוא צבע הקושר חומצות גרעין כפולות נטושות פלואורסים כתומים כאשר הוא מואר באור UV. שים לב כי EtBr הוא פוטנציאל מסרטן, כך ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה, כפפות עמידות EtBr) חייב להיות משוחק.
  7. יוצקים את הג'ל המותך לתוך מגש יציקה של ג'ל אלקטרופורזה. ודא כי אין בועות לכודות בתוך agarose. מניחים מסרק לתוך הג'ל ומהדקים בבטחה. המתן כ 20-30 דקות עד שהג'ל יתמצה.
  8. לאחר הג'ל התגבש, להסיר את המסרק בזהירות מבלי לגרום לדמעות בג'ל. המסרק יוצר בארות בג'ל לטעינת הדגימות.

5. אלקטרופורזה ג'ל

  1. מניחים את ג'ל אגרוז מוצק לתוך תא אלקטרופורזה.
  2. מוסיפים את מאגר הריצה המתאים לתא עד שהג'ל בקושי שקוע.
  3. על חתיכת Parafilm, כתמי פיפטה של תרכיז צבע טעינה. כלול גם סולם DNA של מגוון מתאים לגדלים הצפויים של מוצרי PCR. לחלופין, השתמש קבוצה חדשה של צינורות microfuge, אחד עבור כל מדגם.
  4. לאחר ה- PCR, יש לאחזר את רצועת 8 הצינורות מהתרמוסקלר, ובקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף עיבויים. הוסיפו נפח מתאים של מוצר DNA לצבע הטעינה והפפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. לדוגמה, 2 μL של צבע טעינה 10x מעורבב עם 8 μL של מדגם כדי לתת נפח סופי של 10 μL, עם הצבע ב 1x.
  5. פיפטה כל תערובת דגימת צבע לתוך בארות המיועדות בג'ל אגרוז, נזהר לא לנקב את בארות.
  6. חבר את האלקטרודות לתא האלקטרופורזה. הדנ"א טעון לרעה, כך שהוא "רץ" לעבר האלקטרודה החיובית. לכן, לחבר את האלקטרודה החיובית לצד הנגדי של התא, שם בארות היו טעונות. הגדר את ספק הכוח למתח המתאים למערכת החיץ ולגודל תא הג'ל, והגדר אותו לפעול. בועות קטנות צריכות להיות גלויות נעות במעלה צידי התא אם האלקטרופורזה מתקדמת כראוי.
  7. ברגע שחזית הצבע התקדמה מספיק במורד הג'ל, כבה את אספקת החשמל. בזהירות להעביר את הג'ל לתוך transilluminator או הדמיה חזותית ולהדליק את אור UV כדי לדמיין את רצועות ה- DNA על הג'ל.
  8. לנתח את גודל הרצועה ואת המיקום על הג'ל. השווה את מיקומי הרצועה של הדגימות לשליטה החיובית כדי לקבוע אם DNA מהאורגניזם מעניין נמצא במדגם (איור 1).
רכיב נפח לכל צינור (μL) נפח עבור 5 צינורות (μL) ריכוז סופי
10x חוצץ אקס טאק 5.0 25 1x
2.5 מ"מ של dNTPs 4.0 20 0.2 מ"מ
פריימר קדמי* 2.0 10 400 ננומטר
פריימר הפוך* 2.0 10 400 ננומטר
מולקולרית H2O 31.75 158.75 -
אקס טאק 0.25 1.25 2.5 U
תערובת PCR 45 225

טבלה 1. אמצעי אחסון ריאגנט עבור תערובת מאסטר PCR. *נפחי הפריימר משתנים בהתאם לאי-ההסתעפות של האורגניזם. התאם את נפח המים המולקולריים כדי להפוך את הנפח הסופי 45 μL. אמצעי אחסון של רכיבים אחרים אינם אמורים להשתנות.

% מומלץ של אגרוז רזולוציה אופטימלית עבור שברי DNA ליניאריים (זוגות בסיס)
0.5 1,000-30,000
0.7 800-12,000
1.0 500-10,000
1.2 400-7,000
1.5 200-3,000
2.0 50-2,00

טבלה 2. גודל שבר DNA טווחים נפתרו בצורה אופטימלית על ידי אחוזי ג'ל אגרוז שונים.

תגובת שרשרת הפולימראז( פולימראז) היא טכניקה ביולוגית בסיסית המיושמת באופן נרחב לאיתור וזיהוי מיקרואורגניזמים הקיימים בקרקע, במים ובדגימות סביבתיות אחרות.

באופן קלאסי, מיקרואורגניזמים מתורבתים במעבדות באמצעות מדיה צמיחה מיוחדת. עם זאת, חיידקים רבים בסביבה הטבעית הם "לא פולחן" - או בגלל שיש להם פעילות מטבולית נמוכה מאוד או קצב צמיחה, או בגלל שיש להם דרישות צמיחה מחמירות מאוד כי לא יכול להיות משוכפל בצלחת תרבות. ההבדלים בפולחן בין חיידקים פירושם גם שכאשר מיקרואורגניזמים מדגם סביבתי מתורבתים, השפע היחסי שלהם בתרבות עשוי שלא לשקף את רמותיהם בפועל בסביבה.

הופעתו של PCR, אשר יכול במיוחד להגביר אפילו כמויות קטנות של DNA נוכח במדגם מעורב, מאפשר לזהות במהירות לזהות ולזהות חיידקים ספציפיים של עניין, אפילו אלה שאינם culturable, בתוך מגוון מורכב של אורגניזמים נוכחים במדגם סביבתי.

וידאו זה יציג את העקרונות של PCR. לאחר מכן הוא ידון בפרוטוקול כללי לביצוע PCR על DNA מבודד מדגימה סביבתית על מנת לזהות את נוכחותו של אורגניזם של עניין. לבסוף, ייבדקו מספר יישומים של זיהוי חיידקים מבוסס PCR.

הנחת היסוד של PCR היא להשתמש במחזורים חוזרים ונשנים של שינויי טמפרטורה רציפים כדי להשיג הגברה מעריכית של DNA, בדרך כלל עם מכונה המכונה thermocycler מחזור אוטומטי דרך הטמפרטורות השונות. סינתזת הדנ"א מתבצעת על ידי אנזימי פולימראז DNA המתקבלים מחיידקים החיים במעיינות חמים, כגון תרמיוס אקווטיקה או "טאק". פולימראזים אלה הם חום יציב, המאפשר להם לעמוד בטמפרטורות הגבוהות המשמשות במהלך PCR.

רצף היעד, המכונה אמפליסון, מוגבר מתבנית ה- DNA באמצעות שתי רצועות קצרות של נוקלאוטידים המכונים "פריימרים". בגלל הספציפיות הגבוהה של כריכת חומצת גרעין משלימה, הפריימרים מאפשרים הגברה ממוקדת של רצפים ספציפיים מאוד של עניין. על ידי עיצוב פריימרים שרק יגבירו רצף ייחודי, או שילוב ייחודי של רצפים, מאורגניזם מעניין, ניתן להשתמש ב- PCR כדי לזהות באופן דיפרנציאלי את נוכחות הדנ"א של האורגניזם בין כל החומרים הגנטיים הקיימים בדגימה סביבתית מורכבת.

כל מחזור PCR מחולק לשלושה שלבים. הראשון, המכונה "denaturation", מוגדר בדרך כלל מעל 92 °C (70 °F) ונמשך כ -30 מעלות צלזיוס. דנטורציה משמשת לפירוק מולקולות DNA לגדילים בודדים, כדי לאפשר לתגובת ההגברה להמשיך.

השלב השני, "חישול", מוגדר 2 עד 3 °C (5 °F) מתחת לטמפרטורת ההיתוך של שני פריימרים, בדרך כלל בין 50 ל 65 °C (70 °F), וגם נמשך על 30 מעלות צלזיוס. טמפרטורת ההיתוך היא הטמפרטורה שבה 50% ממולקולות הדנ"א הכפולות נפרדו לגדילים בודדים, ולכן שלב ההמסה מאפשר לפריימרים להיקשר לאתרי היעד שלהם בתבנית הדנ"א.

השלב השלישי של מחזור PCR הוא "התארכות" או "הרחבה", כאשר פולימראז ה- DNA נקשר לדופלקס תבנית פריימר ומזרז סינתזה של הגדילים החדשים. מוגדר על 72 °C עבור פולימראז PCR הנפוץ ביותר, טאק, משך שלב זה תלוי באורך של אמפליסון, בדרך כלל 30 s לכל 500 basepairs. לאחר כל מחזור, ה- DNA המוגבר שוב מושמצת ומשמש כתבנית חדשה, מה שמוביל לעלייה מעריכית בכמות מוצרי ה- PCR.

לאחר השלמת התגובה, ניתן לפתור את מוצרי ה- PCR לפי גודל על "ג'ל" העשוי בדרך כלל אגרוז פולימר, תהליך המכונה אלקטרופורזה. שדה חשמלי מוחל על פני הג'ל, והמטענים השליליים בעמוד השדרה של מולקולות ה- DNA גורמים להם לנדוד לעבר הקצה החיובי של השדה. באופן כללי, מולקולות DNA ליניאריות גדולות יותר ייקח יותר זמן לנסוע דרך מטריצת הג'ל.

עכשיו שאתם מבינים איך פי.סי.אר עובד, בואו נסתכל איך התגובה יכולה לשמש לזיהוי מיקרואורגניזמים במדגם סביבתי.

כדי להתחיל, חשב את הנפח של כל ריאגנט הדרוש בהתבסס על מספר הדגימות שיש לעבד, בתוספת 10% נוספים כדי להסביר שגיאות צנרת. יש לכלול תבנית בקרה חיובית - המכילה את אזור היעד - כדי להבטיח שהתגובה פועלת; כמו גם שליטה שלילית שבה לא נכללת תבנית DNA, על מנת לשלול זיהום באף אחד מרכיבי התגובה. שמור את האנזים פולימראז טאק על קרח, ולהפשיר את שאר ריאגנטים ואת דגימות ה- DNA בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינאר ייעודי כדי למנוע זיהום.

לאחר שכל הריאגנטים הפשירו, מהווים את "תערובת המאסטר" המחודשת על ידי הוספת הנפח המחושב של כל ריאגנט לצינור מיקרו-פוגה בעל כריכה נמוכה, הממזערת פערים בכמויות ריאגנטיות עקב ספיחה של מולקולות על פני השטח של הצינור. מערבולת בעדינות וצנטריפוגות כל ריאגנט לפני הוספת. לאחר תערובת המאסטר מוכן, מערבולת לערבב ולאסוף על ידי צנטריפוגה.

סמן רצועת PCR בעלת 8 צינורות כדי לייעד שפופרת אחת לכל דגימה, כולל הפקדים. מחלקים את הכמות המתאימה של תערובת מאסטר PCR לכל שפופרת של הרצועה. לאחר מכן, הוסף כל דגימת DNA לצינור המתאים.

מניחים את מכסה הרצועה בבטחה על צינור הרצועה, וצנטריפוגה לזמן קצר במיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה. לאחר מכן, למקם את הצינור לתוך thermocycler, ולהפעיל את התגובה על פי תוכנית PCR המתאימה.

בזמן PCR מופעל, להכין ג'ל אגרוז עבור אלקטרופורזה של מוצרי PCR. לשקול כמות מתאימה של אבקת אגרוז עבור ג'ל עם ריכוז שיכול לפתור את מוצרי PCR בהתבסס על הגדלים הצפויים שלהם. מוסיפים את האגרוז לבקבוקון 125 מ"ל, ואז מוסיפים את הנפח המתאים של חוצץ ג'ל לבקבוקון, בהתבסס על נפח יציקת הג'ל, ומערבבים לערבב. במיקרוגל את תמיסה אגרוז בעוצמה גבוהה במשך 1 דקות. לאחר השלמת, ודאו שהאגורוז נמס לחלוטין על ידי מערבולת הבקבוקון, וחזרו על מיקרו-מיקרוגל במרווחים של 30 מעלות במידת הצורך.

חזק לאבטח את המכסה על הבקבוק, ולקרר את פתרון agarose ל 50 °C (50 °F) על ידי מערבולת הבקבוקון תחת מים קרים זורמים. לאחר התקררות, להוסיף 1 μL של אתידיום ברומיד לאגרוז. מכיוון שאתידיום ברומיד הוא בעל פוטנציאל מסרטן, הקפד ללבוש ציוד מגן אישי כגון משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות עמידות בפני אתידיום ברומיד.

יוצקים את תמיסת אגרוז למגש יציקת ג'ל אלקטרופורזה, ומוודאים שאין בועות אוויר לכודות בתוך האגורוז. מניח מסרק עם המספר הנדרש של בארות לתוך הפתרון. השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות כדי להתמצץ. לאחר הג'ל מוגדר, בזהירות להסיר את המסרק, הקפד לא לקרוע את הג'ל בתהליך.

מניחים את הג'ל המוצק לתוך תא האלקטרופורזה. מוסיפים חוצץ LB לתא עד שהג'ל פשוט שקוע. על פיסת Parafilm, pipette "כתם" של סולם DNA של טווח מתאים לגודל הצפוי של מוצרי PCR. לאחזר את צינורות PCR עם התגובות שהושלמו מן thermocycler. לאסוף עיבויים בצינורות PCR על ידי צנטריפוגה קצרה, ולהוסיף 8 μL של כל מדגם על Parafilm. הוסף 2 μL של צבע טעינה 10x לכל נקודה של מוצר PCR, כך הריכוז הסופי של הצבע הוא 2x.

טען את הדגימות והסולם לתוך בארות ייעודיות בג'ל אגרוז, נזהר לא לחטט דרך הג'ל. לאחר השלמת הטעינה, לשים את המכסה לתא אלקטרופורזה, ולחבר את האלקטרודות לאספקת החשמל. מכיוון שהדנ"א טעון לרעה ונודד לכיוון האלקטרודה החיובית, ודאו שהבארות נמצאות בצד קרוב יותר לאלקטרודה השלילית. הפעל את ספק הכוח והגדר אותו למתח המתאים לגודל תא האלקטרופורזה ולמערכת החיץ הנמצאת בשימוש. הגדר את האלקטרופורזה ל"הפעלה". בועות קטנות הנעות במעלה צידי התא ייראו אם האלקטרופורזה מתקדמת כראוי.

ברגע שחזית הצבע התקדמה מספיק במורד הג'ל, כבה את אספקת החשמל. בזהירות להעביר את הג'ל לדימוי ג'ל כדי לדמיין את המוצרים electrophoresed. עם מגן, להפעיל את אור UV ולדמיין את רצועות ה- DNA על הג'ל. לנתח את המיקום של הלהקות כדי לראות אם זה תואם את התבנית הצפויה המצביעה על נוכחותם של המינים של עניין במדגם הסביבתי.

עכשיו שראיתם איך PCR מבוצע, בואו נסתכל על דרכים שונות זה מוחל כדי לזהות מיקרואורגניזמים של עניין בסביבה.

שימוש אחד בגילוי מיקרוביאלי סביבתי מבוסס PCR הוא לזהות אורגניזמים הגורמים למחלות כגון "אמבה אוכלת מוח" Naegleria fowleri, אורגניזם חד-תאי שנמצא בגופי מים מתוקים ובבריכות ללא חיסון שיכולים לתקוף את מערכת העצבים האנושית, לעתים קרובות באופן קטלני. נוכחותו של חיידק קטלני זה בדגימות מים או בנוזל השדרתי של חולים חשודים יכולה להיבדק על ידי ביצוע PCR באמצעות פריימרים המתמקדים ברצפי DNA ייחודיים בגנום של אמבה.

יישום נוסף לזיהוי מיקרוביאלי מבוסס PCR הוא לבדוק את נוכחותם של חיידקים פתוגניים בזבובים שנתפסו בקרבת מפעלי מזון, כחלק מפיקוח על בריאות הציבור וחקירות התפרצות מחלות.

כאן, החוקרים חיפשו את נוכחותם של חיידקים פתוגניים כגון סלמונלה וליסטריה, על ידי בידוד תחילה של חיידקים הן מפני הגוף והן מתעלת העיכול של זבובים, ולאחר מכן באמצעות תנאי תרבות ספציפיים למינים כדי להעשיר עבור מינים אלה של עניין. לאחר חילוץ DNA מכל חיידקים שהיו בתרבית, ערכות PCR לזיהוי ספציפיות למינים זמינות מסחרית שימשו לבדיקת זהותם.

לבסוף, זנים שונים של חיידקים פתוגניים עמידים לאנטיביוטיקה כגון Staphylococcus aureus, אשר מציגים חששות גדולים לבריאות הציבור, ניתן לזהות ולהבדיל עם PCR.

בדוגמה זו, החוקרים בודדו ותרבידו S. aureus מדגימות קליניות, לאחר מכן חילצו DNA ממושבות החיידקים וביצעו PCR. תגובות ההגברה כאן היו "מולטיפלקסים", כלומר ערכות פריימר מרובות המכוונות לאזורים ייחודיים שונים של הגנום החיידקי שולבו לאותה תגובה. ערכות פריימר בודדות תוכננו כך שמוצרי PCR נובעים מדנ"א של זנים מסוימים בלבד אך לא של אחרים, כך שבשילוב נצפו דפוסי רצועת מוצרים ייחודיים עבור כל זן.

הרגע צפית בסרטון של JoVE על זיהוי מיקרואורגניזם מבוסס פי.סי.אר. בדקנו את העקרונות שמאחורי תגובת שרשרת הפולימראז; פרוטוקול לביצוע PCR על DNA המופק ממיקרואורגניזמים סביבתיים; ולבסוף, מספר יישומים ספציפיים של טכניקה זו כדי לבדוק אורגניזמים של עניין בסוגים שונים של דגימות סביבתיות או קליניות. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

באיור 1, סולם הדנ"א (נתיב 1) מספק התייחסות לגודל ולריכוז המשוער של רצועות של מוצרי ה-PCR. השליטה השלילית (נתיב 2) אינה מכילה כל חומר גנטי, בעוד הפקד החיובי (נתיב 3) מוגבר מתבניות הידועות כמכילות את ה- DNA המשמש כיעד כדי לציין את הגודל והמיקום של רצועות היעד. דגימות 4, 6, 8 ו-9 מציגות דפוס פס דומה לזה של השליטה החיובית, ולכן מצביעות על כך שדגימות אלה מכילות את החומר הגנטי של היעד. ניתן להסיק כי האורגניזם קיים בסביבות שמהן הושגו דגימות אלה.

Figure 1
איור 1. לדמיין להקות על ג'ל אגרוז בעקבות אלקטרופורזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PCR יכול להיות מועסק כדי לקבוע במהירות את נוכחות או היעדר פתוגנים בסביבה. לדוגמה, פריימרים ספציפיים אמבה אוכל המוח, Naegleria fowleri, יגבירו את ה- DNA וייצרו רצועות חזקות על ג'ל אם האורגניזם נמצא במדגם. אם אורגניזם יחיד אינו העניין העיקרי, אלא גנים הקשורים לייצור רעלים ממגוון אורגניזמים, PCR יכול לשמש גם כדי לקבוע את נוכחותם או היעדרם של חומרים גנטיים ספציפיים אלה.

PCR יכול לשמש גם כהליך אישור בעת ניתוח חיידקים סביבתיים במעבדה. אם שיטת תרבית אינה יכולה להבדיל בין אורגניזמים מסוימים הנמצאים במדגם סביבתי, אז PCR אולי משמש להבחין באופן ספציפי בין חיידקים המועמדים.

PCR קונבנציונאלי ניתן לשנות במספר דרכים למטרות ניסיוניות מסוימות. ניתן להשתמש ב- PCR כדי לנתח תבניות RNA חד-גדיליות על-ידי צימוד לשלב שעתוק הפוך (RT-PCR). מעבר לקביעת נוכחות לעומת היעדרות, PCR כמותי (qPCR) יכול למדוד את הריכוז עבור DNA ספציפי של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter