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ポリメラーゼ連鎖反応およびゲル電気泳動法と環境微生物の検出
 

ポリメラーゼ連鎖反応およびゲル電気泳動法と環境微生物の検出

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ポリメラーゼの連鎖反応、または PCR は、検出および識別する土、水および他の環境のサンプルで現在の微生物に広く適用される基本的な生物学的手法です。

古典的な微生物が特殊な成長媒体を使用してラボで培養です。ただし、自然環境に多くの微生物は「培養」- または彼らは非常に低い代謝活動や成長率を持っているので、彼らは培養皿にレプリケート可能ではないかもしれない非常に厳しい成長の要件を持っているので。Culturability 微生物間の相違はまた、環境試料からの微生物が培養、文化相対的な豊富が反映していないこと、環境での実際のレベルを意味します。

混合サンプルで現在の DNA の少量を増幅することが具体的には、pcr 法の導入により、迅速に検出・培養、生物環境のサンプルで現在の複雑な品揃えでいるものも興味の特定微生物を識別することが可能。

このビデオは、PCR の原理をご紹介いたします。それは興味の生物の存在を検出するために環境試料から分離された DNA の PCR を行うための一般的なプロトコルを話し合います。最後に、PCR に基づく微生物の同一証明のいくつかのアプリケーションが探求されます。

PCR の基本的な前提は、異なった温度を自動的に循環する、たちとして知られているマシンで通常 DNA の指数関数的増幅を達成するために連続した温度変化のサイクルを繰り返し使用することです。DNA 合成は好熱菌や「Taq」など、温泉に住んでいる細菌から得られる DNA のポリメラーゼの酵素によって行われます。これらのポリメラーゼは、熱安定性、PCR の間に使用される高温に耐えるように。

私アンプリコン、として知られているターゲット シーケンスは、「プライマー」として知られているヌクレオチドの 2 つの不足分の伸張を使用して DNA のテンプレートから増幅されています。相補的な核酸結合の高い特異性、ためプライマーは、関心の非常に特定のシーケンスのターゲットの増幅できます。一意のシーケンスまたはシーケンス、関心の有機体からのユニークな組み合わせを増幅するプライマーを設計することによって特異的遺伝物質が複雑な環境試料中に存在するすべての生物の DNA の存在を検出する PCR を使用できます。

各 PCR のサイクルは、3 つのフェーズに分かれています。最初に、「変性」として知られている、通常、上記の 92 ° C と続く約 30 s. 変性増幅反応を続行を許可するための単一繊維 DNA の分子に分割するために使用設定。

「熱処理」、2 番目のフェーズは 2 に 3 ° C 2 つのプライマーの溶ける温度の下限を設定、通常 50 に 65 ° C からも続く間約 30 s. 溶融温度は二本鎖 DNA の 50% が分子が単一繊維に分離温度およびアニーリング ・ ステップできるようにプライマーが DNA テンプレートのターゲット サイトに結合します。

PCR のサイクルの第 3 段階は、「伸び」や「拡張」, DNA ポリメラーゼは、プライマー テンプレート二重にバインドし、新しい鎖の合成を触媒します。最も一般的に使用される PCR のポリメラーゼ、Taq、72 ° C で設定このフェーズの期間によって異なります私アンプリコン、通常 30 の長さ秒・ 500 ヒト。各サイクル後増幅された DNA 変性はもう一度、PCR の製品の量の急激な増加につながる新しいテンプレートとして提供しています。

反応が完了したら、PCR の製品は電気泳動と呼ばれるプロセス、ポリマー agarose の通常作られて「ゲル」でサイズによって解決できます。Dna のバックボーンで負電荷フィールドの肯定的な端の方に移住する原因し、電界が、ゲルの上で適用されます。一般的に言えば、大きい線形 DNA の分子はゲルのマトリックスを通して旅行がかかります。

PCR のしくみを理解したら、反応を使用して、環境試料中の微生物を特定する方法を見てをみましょう。

まず、ピペッティング エラーを考慮して追加 10% プラス処理されるサンプルの数に基づいて各試薬の必要量を計算します。-対象地域を含む - 肯定的な制御テンプレートは反応が動作していることを確認する含まれているべき否定的なだけでなく、DNA のテンプレートが反応コンポーネントのいずれかで汚染を排除するために、含まれていないを制御します。氷の上 Taq ポリメラーゼの酵素を保ち、残りの試薬と室温で汚染を防ぐために指定された層流フードの DNA サンプルを解凍します。

すべての試薬が解凍後、チューブ表面への分子の吸着による試薬量の不一致を最小限に抑える低結合および microfuge の管に各試薬量の集計を追加することで、試薬「マスター ミックス」を構成します。優しく渦、追加する前に各試薬を遠心力場します。一度マスター ミックスは準備される、渦をミックスし、遠心分離によって収集します。

各サンプルは、コントロールを含む 1 つの管を指定する 8 チューブ PCR ストリップにラベルを付けます。ストリップの各チューブに PCR マスター ミックスの適切な量を調剤します。次に、それぞれのチューブに各 DNA のサンプルを追加します。

ストリップ管を安全にストリップ キャップを置き、ストリップ アダプターとミニ遠心分離の遠心分離機の簡潔に。たちに管を配置し、適切な PCR プログラムに従って反応を実行します。

PCR を実行すると、PCR 産物の電気泳動用アガロース ゲルを準備します。PCR の製品のサイズに基づいて解決できる濃度ゲルの agarose 粉末の適切な量を重量を量る。125 mL フラスコ agarose を追加し、フラスコ、キャスト、ゲルの量に基づいて、ミックスに渦巻きにゲルの連続したバッファーの適切なボリュームを追加します。1 分のハイパワーでアガロース溶液を電子レンジします。完了したら、agarose が渦巻くこと、フラスコに完全に溶解を確認し、必要な場合、30 の単位で電子レンジを繰り返します。

しっかりと、フラスコにキャップを確保し、冷たい水を実行して下のフラスコを旋回で 50 ° C にアガロース溶液を冷却します。いったん冷却、agarose にエチジウム ブロマイドの 1 μ L を追加します。臭化エチジウムは潜在的に発癌、必ずエチジウム ブロマイド手袋、白衣、ゴーグルなどの保護具を着用します。

Agarose 内で閉じ込められている気泡がないかどうかを確かめて、電気泳動ゲル鋳造トレイにアガロース溶液を注ぐ。ソリューションに必要な井戸数と櫛を配置します。固めるための 20 から 30 分の室温でゲルを残します。一度ゲルを設定すると、プロセスでゲルを破らないように必ず櫛を慎重に取り外します。

固化したゲルを電気泳動室に配置します。ゲルは水中だけまでチャンバーに LB バッファーを追加します。パラフィルムの部分、上にピペットの PCR の製品の予測されるサイズの適切な範囲の DNA の梯子の「スポット」。たちから完成した反応と PCR チューブを取得します。簡単なの遠心分離によって PCR チューブ凝縮体を収集し、パラフィルム上に各サンプルの 8 μ L を追加します。PCR の製品の各スポットにローディングの染料 × 10 の 2 μ L を追加すると、染料の最終濃度は 2 倍。

Agarose のゲル、ゲルを通ってを突かないように注意しながら、指定された井戸にサンプルとはしごを読み込みます。読み込みが完了すると、電気泳動室に蓋の上に置くし、電極を電源装置に接続します。DNA は負に帯電し、肯定的な電極の方に移行、以来は、井戸マイナス電極に近い側に確認します。電源をオンにし、電気泳動室と使用されるバッファー システムのサイズに適切な電圧に設定。電気泳動を「実行する」を設定します。商工会議所の側面を移動の小さな泡になります電気泳動が正しく進んでいるかどうかを観察。

染料フロントはゲルを十分にずっと進んだ、電源をオフにします。慎重に electrophoresed 製品を視覚化するゲルのイメージャーとゲルを輸送します。保護シールドをオンに UV 光とゲルの DNA バンドを可視化します。それに予想されるパターンは環境サンプルの興味の種の存在を示す一致するバンドの位置を分析します。

今では PCR を実行する方法を見て、それが適用される様々 な方法を見てみましょう、環境への関心の微生物を検出します。

PCR 基づかせていた環境微生物検出の 1 つの使用は「脳を食べるアメーバ」など病気を引き起こす有機体を識別するために、フォーラーネグレリア、新鮮な水体としばしば致命的な人間の神経系を攻撃することができます unchlorinated プールは、単一のセルの生物。アメーバのゲノムのユニークな DNA シーケンスをターゲットのプライマーを用いて PCR を行い、水中のこの致命的な微生物の存在またはが疑われる患者の脳脊髄液をテストできます。

PCR による微生物同定のための別のアプリケーションは、はえ公衆衛生監視と疾患アウトブレイクの調査の一部として食品事業所付近における病原性細菌の存在をテストすることです。

ここでは、調査官はまず体表面とハエ、消化管からの細菌を隔離するし、興味のこれらの種の豊かに種特異的な培養条件を使用してリステリア菌、サルモネラ菌などの病原性細菌の存在を見た。培養した菌から DNA を抽出した後市販の種特異的検出 PCR キットは、自分のアイデンティティをテストするため使用されました。

最後に、主要な公衆衛生問題である黄色ブドウ球菌などの抗生物質耐性の病原性細菌の異なった緊張を識別し、PCR と区別できます。

この例では、研究者は分離し臨床検体から黄色ブドウ球菌を培養し、細菌のコロニーから DNA を抽出し、PCR を行った。増幅反応をここで「多重化された」、細菌ゲノムの異なるユニークな地域をターゲットと複数のプライマー セットが同じ反応に結合されたことを意味します。個々 のプライマー セットは、各緊張に認められたバンド パターンのユニークな商品の組み合わせで、のみいくつかの系統が、その他の DNA にして PCR の製品ができるように設計されました。

PCR に基づく微生物の検出にゼウスのビデオを見てきただけ。ポリメラーゼの連鎖反応の原理を見てきました環境の微生物から抽出した DNA の PCR を行うためのプロトコルそして最後に、いくつか特定のアプリケーションこの手法の異なるタイプの環境または臨床サンプルに興味の生物をテストします。見てくれてありがとう!

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