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중합 효소 연쇄 반응 및 겔 전기 영동을 통한 환경 미생물 검출
 
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중합 효소 연쇄 반응 및 겔 전기 영동을 통한 환경 미생물 검출

Overview

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠

중합체 연쇄 반응 (PCR)은 토양, 물 및 대기 환경에 존재하는 미생물을 검출하는 데 사용되는 기술입니다. DNA의 특정 섹션을 증폭시킴으로써, PCR은 종, 균주 및 세로바/파토바 수준으로 표적 미생물의 검출 및 식별을 용이하게 할 수 있다. 이 기술은 또한 견본에 있는 미생물의 전체 지역 사회를 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

전문 성장 매체를 사용하여 실험실에서 미생물의 배양은 오랜 기술이며 환경 샘플에서 미생물의 검출을 위해 사용 되어 있습니다. 자연 환경에 있는 많은 미생물, 살아있는 동안, 신진 대사 활동의 낮은 수준을 유지 하 고/또는 두 배로 시간 따라서 실행 가능 하지만 비 culturable (VBNC) 유기체로 불립니다. 배양 기반 기술의 사용은 이러한 미생물을 감지할 수 없으므로 샘플에서 미생물 집단에 대한 철저한 평가를 제공하지 않습니다. PCR의 사용은 유전 서열의 증폭이 일반적으로 환경 견본에 존재하는 미생물의 사전 농축을 요구하지 않기 때문에, 더 이상 살아 있거나 활성화되지 않는 세균, VBNC 유기체 및 그(것)의 검출을 허용합니다. 그러나 PCR은 앞서 언급한 생존 가능성 및 활동 상태를 구분할 수 없습니다. 하나 이상의 배양 기반 기술과 결합될 때, 미생물의 특정 하위 집합의 생존가능성은 여전히 결정될 수 있다.

Principles

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PCR의 기본 전제는 DNA의 기하급수적 증폭을 달성하기 위해 순차적 온도 변화의 반복 주기를 사용하는 것입니다. DNA 합성은 테무스 수생(Taq)과 같은 온천에 사는 박테리아로부터 얻어지는 DNA 중합효소에 의해 수행된다. 이러한 폴리머라제는 열이 안정되어 PCR 중에 사용되는 고온을 견딜 수 있습니다.

앰플리코로 알려진 표적 서열은 "프라이머"로 알려진 뉴클레오티드의 두 개의 짧은 스트레칭을 사용하여 DNA 템플릿으로부터 증폭된다. 상보핵산 결합의 높은 특이성 때문에, 프라이머는 매우 구체적인 관심 서열의 표적 증폭을 허용한다. 관심 있는 유기체로부터 고유한 서열(또는 서열의 독특한 조합)만 증폭시키는 프라이머를 설계함으로써, PCR은 복잡한 환경 샘플에 존재하는 모든 유전 물질 들 사이에서 해당 유기체의 DNA의 존재를 차별화적으로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

PCR을 수행하기 위해 열순환기로 알려진 기계가 반응에 필요한 다양한 온도를 자동으로 순환하는 데 사용됩니다. 각 주기는 3단계로 나뉩니다. 첫 번째, "데나포화"로 알려진, 일반적으로 92 °C 이상 설정 하 고 약 30 s 지속. 부인은 DNA 분자를 단일 가닥으로 분해하여 증폭 반응을 진행하는 것을 허용하는 데 사용됩니다.

제2상 "어닐링"은 일반적으로 50-65°C 사이, 두 프라이머의 용융 온도의 하부 아래 2-3°C를 설정하고 약 30초 동안 지속된다. 용융 온도는 이중 좌초 된 DNA의 50 %가 단일 가닥으로 분리되어 있으므로 어닐링 단계는 프라이머가 DNA 템플릿의 대상 부위에 결합 할 수 있게합니다.

PCR 사이클의 제3단계는 DNA 폴리머라제가 프라이머 템플릿 이중에 결합하고 제품의 합성을 촉매할 때 "신장" 또는 "확장"이다. Taq 폴리머라제에 대해 72°C로 설정된 이 단계의 지속 시간은 앰플리콘의 길이, 보통 30s/500 bp에 따라 달라집니다. 각 주기 후에, 증폭된 DNA는 다시 한번 변성되고 PCR 제품의 양이 기하급수적으로 증가하는 이끌어 내는 새로운 템플릿으로 봉사합니다.

반응이 완료되면 PCR 제품은 일반적으로 중합체 아가로즈로 만들어진 "젤"의 크기로 해결할 수 있으며, 이는 전기전주로 알려진 공정이다. 전기장은 젤 전체에 적용되고 DNA 분자의 중추에 있는 음전하로 인해 필드의 양수 끝으로 이동하게 됩니다. 일반적으로 말하자면, 더 큰 선형 DNA 분자는 젤 매트릭스를 통과하는 데 더 오래 걸릴 것입니다.

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Procedure

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1. 샘플 수집

  1. 오거 또는 삽을 사용하여 토양을 채집하여 결정된 깊이로 내려간다. 뿌리 부각 (주변 토양의 좁은 영역 및 식물 뿌리와 관련 미생물에 의해 영향을 받는 토양의 좁은 영역)에서 토양을 수집하는 경우, 단지 수집 배럴에 토양을 타격하여 식물 뿌리 주위에서 직접 수집합니다.
  2. 침지 스틱의 끝을 들고 있는 동안 멸균 플라스틱 병을 물에 담그어 물 샘플을 수집합니다.

2. 핵산 추출 및 준비

  1. 샘플에서 유기체와 바이러스를 수집하고 그들로부터 DNA와 RNA를 추출합니다. 자세한 내용은 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.
  2. 표지된 마이크로퍼지 튜브에 추출된 DNA를 저장합니다. DNA를 하룻밤 또는 더 긴 시간 동안 보관해야 하는 경우 -20°C에서 동결하고 사용할 준비가 되면 실온에서 튜브를 해동하십시오.
  3. 분석될 유전 물질이 RNA(RNA 바이러스의 게놈이든, 또는 세포 유기체의 전사된 RNA이든) PCR로 진행하기 전에 상호 보완적인 DNA(cDNA)를 생성하기 위해 샘플상에서 역전사(RT)를 수행한다. 자세한 내용은 RT-PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

3. 중합체 연쇄 반응

  1. PCR효소(예: Taq 폴리머라제)를 얼음 위에 놓고 실온에서 지정된 "클린" 후드 내부에 다른 시약(PCR 버퍼, dNTP, 프라이머)을 해동한다. 효소는 -20 °C에 저장되지만 결코 얼지 않습니다. 온도에 민감하므로 시원하게 유지되어야 하며 주변 온도에 대한 노출이 최소화되어야 합니다.
  2. 모든반응(표 1)에서일정한 모든 시약의 "마스터 믹스"를 만드는 데 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 계산에서양수(예:대상 영역을 포함하는 것으로 알려진 템플릿)와 네거티브(예: 템플릿 없음)를 고려해야 합니다. 파이펫팅 오류를 고려하여 최종 볼륨에 10%를 추가합니다. 프라이머 볼륨은 특정 유기체에 대한 저서에 의존합니다. 적절한 값에 대해 출판된 문헌을 참조하십시오.
  3. 플라스틱 벽에 시약 분자의 접착을 최소화하는 저결합 미세 분리 튜브를 사용하여 각 시약의 계산된 볼륨을 추가하여 마스터 믹스를 조립합니다. 추가하기 전에 각 시약마다 부드럽게 소용돌이와 원심분리기를 넣습니다. 마스터 믹스가 준비되면, 소용돌이를 혼합하고 원심분리에 의해 수집
  4. 8튜브 PCR 스트립을 준비합니다. 양수 및 음수 컨트롤을 포함하여 각 샘플에 대한 튜브 지정
  5. 스트립의 각 튜브에 PCR 혼합물의 적절한 볼륨을 분배
  6. 샘플에서 DNA 템플릿의 적절한 볼륨뿐만 아니라 양수 템플릿의 5 μL과 분자 등급 물의 5 μL을 음의 대조군으로 추가하여 각각의 PCR 튜브에 넣습니다.
  7. 캡을 8튜브 스트립과 원심분리기에 미니센트리슈어지를 사용하여 몇 초 간 단단히 놓습니다.
  8. 온도 사이클러에 8 튜브 스트립을 배치
  9. 열순환기에서 실행할 적절한 PCR 프로그램을 설정합니다. 일반적인 프로그램은 다음과 같은 것으로 구성됩니다.
    1. 94°C에서 3분 동안 의결.
    2. 증폭의 30-40 사이클: 30초에 대한 94°C에서 의 약화, 프라이머 별 온도(보통 50~60°C 사이)에서 30초, 30초/500bp에 72°C로 연장하였다.
    3. 7-10 분 동안 72 °C에서 최종 연장.

4. 아가로즈 젤 준비

  1. 원하는 젤 부피 및 겔농도(표 2)에기초하여, 125mL 에렌마이어 플라스크에 아가로즈 분말의 적량을 계량한다.
  2. 적절한 양의 젤 러닝 버퍼를 플라스크에 넣고 플라스크를 손으로 소용돌이시다.
  3. 완충-아가로즈 혼합물을 전자레인지에 넣고 1분간 고출력으로 가열합니다.
  4. 전자레인지에서 플라스크를 제거하고 손으로 소용돌이어 모든 아가로즈가 용해되었는지 확인합니다. 아가로즈가 완전히 용해되지 않은 경우 30분 단위로 마이크로웨이브를 반복합니다.
  5. 플라스크에 캡을 단단히 고정한 후 흐르는 차가운 물 에서 회전하여 50 °C로 식힙니다.
  6. EtBr에 지정된 마이크로핍펫을 사용하여 아가로즈 혼합물에 에티듐 브로마이드(EtBr)의 1μL을 추가합니다. EtBr은 UV 빛으로 비춰질 때 이중 가닥 핵산과 형광 오렌지를 결합하는 염료입니다. EtBr은 잠재적으로 발암성이므로 개인 보호 장비 (고글, 실험실 코트, EtBr 내성 장갑)를 착용해야합니다.
  7. 용융 젤을 전기포고시스 젤 주조 트레이에 붓습니다. 아가로즈 내에 거품이 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 빗을 젤에 넣고 단단히 고정합니다. 젤이 고화될 때까지 약 20-30분 정도 기다립니다.
  8. 젤이 굳어지면 젤에 눈물을 흘리지 않고 조심스럽게 빗을 제거하십시오. 빗은 샘플을 적재하기 위한 젤의 우물을 만듭니다.

5. 젤 전기 전광

  1. 고화된 아가로즈 젤을 전기전도 챔버에 넣습니다.
  2. 젤이 거의 물에 잠길 때까지 적절한 실행 버퍼를 챔버에 추가합니다.
  3. 파라필름, 로딩 염료 농축물의 파이펫 스팟에. 또한 PCR 제품의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리를 포함한다. 또는, 마이크로 퍼지 튜브의 신선한 세트를 사용, 각 샘플에 대해 하나.
  4. PCR이 완료되면 온도 순환기에서 8튜브 스트립을 검색하고 간략하게 원심분리기를 가져와 응축수들을 수집합니다. 적중염과 파이펫에 적절한 양의 DNA 제품을 넣고 혼합합니다. 예를 들어, 10x 로딩 염료의 2μL은 8μL의 샘플과 혼합되어 10 μL의 최종 부피를 제공하며 염료는 1x로 됩니다.
  5. 파이펫 각 염료 샘플 혼합물은 아가로즈 젤의 지정된 우물에 들어가 우물에 구멍을 뚫지 않도록 주의한다.
  6. 전극을 전극챔버에 연결합니다. DNA는 음전하로 충전되므로 양극쪽으로 "실행"됩니다. 따라서 양극을 우물이 로드된 챔버의 반대편에 연결합니다. 전원 공급 장치를 젤 챔버의 완충 시스템 및 크기에 적합한 전압으로 설정하고 실행하도록 설정합니다. 전기전도가 제대로 진행되는 경우 작은 기포가 챔버의 측면을 위로 이동하는 것을 볼 수 있어야 합니다.
  7. 염료 전면이 젤 아래로 충분히 진보되면 전원 공급 장치를 끕니다. 젤을 일루미네이터 또는 시각 이미저로 조심스럽게 운반하고 UV 광을 켜서 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다.
  8. 젤의 밴드 크기와 위치를 분석합니다. 시료의 대역 위치를 양수 대조군과 비교하여 관심 있는 유기체로부터의 DNA가 샘플에 존재하는지 확인한다(도1).
구성 요소 튜브당 부피(μL) 5튜브용 부피(μL) 최종 농도
10x 엑스 타크 버퍼 5.0 25 1x
2.5 mM dNTP 4.0 20 0.2 mM
포워드 프라이머* 2.0 10 400 nM
역프라이머* 2.0 10 400 nM
분자 H2O 31.75 158.75 -
엑스 타크 0.25 1.25 2.5 U
PCR 혼합물 45 225

표 1. PCR 마스터 믹스의 시약 볼륨입니다. *프라이머 볼륨은 유기체 분석에 따라 다릅니다. 분자 등급 물의 부피를 조정하여 최종 부피 45 μL을 만듭니다. 다른 구성 요소의 볼륨은 달라지지 않아야 합니다.

아가로즈 권장% 선형 DNA 단편에 대한 최적의 해상도(기본 쌍)
0.5 1,000-30,000
0.7 800-12,000
1.0 500-10,000
1.2 400-7,000
1.5 200-3,000
2.0 50-2,00

표 2. DNA 단편 크기 범위는 다른 아가로즈 젤 백분율에 의해 최적으로 해결됩니다.

폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR은 토양, 물 및 기타 환경 샘플에 존재하는 미생물을 검출하고 식별하는 데 널리 적용되는 기본 생물학적 기술입니다.

고전적으로 미생물은 특수 성장 매체를 사용하여 실험실에서 배양됩니다. 그러나, 자연 환경에 있는 많은 미생물은 "비 culturable"입니다 - 그(것)들이 아주 낮은 신진 대사 활동 또는 성장 속도를 가지고 있기 때문에, 또는 문화 접시에 복제되지 않을 지도 모르다 아주 엄격한 성장 요구 사항이 있기 때문에. 미생물 간의 컬처성의 차이는 또한 환경 샘플의 미생물이 배양될 때 문화가 상대적으로 풍부하여 환경에 있는 실제 수준을 반영하지 않을 수 있음을 의미합니다.

혼합 샘플에 존재하는 소량의 DNA조차 구체적으로 증폭할 수 있는 PCR의 출현은 환경 샘플에 존재하는 복잡한 유기체 내에서, 비과실수 있는 미생물조차도 관심 있는 특정 미생물을 신속하게 감지하고 식별할 수 있게 합니다.

이 비디오는 PCR의 원칙을 소개합니다. 그런 다음 관심 있는 유기체의 존재를 감지하기 위해 환경 샘플에서 분리된 DNA에 PCR을 수행하기 위한 일반적인 프로토콜에 대해 논의할 것입니다. 마지막으로, PCR 기반 미생물 식별의 여러 응용 프로그램을 탐구할 것입니다.

PCR의 기본 전제는 DNA의 기하급수적 증폭을 달성하기 위해 순차적 온도 변화의 반복 주기를 사용하는 것입니다, 일반적으로 다른 온도를 통해 자동으로 순환 열 사이클러로 알려진 기계와. DNA 합성은 테무스 수생학 또는 "Taq"와 같은 온천에 사는 박테리아로부터 얻어지는 DNA 중합효소에 의해 수행됩니다. 이러한 폴리머라제는 열이 안정되어 PCR 중에 사용되는 고온을 견딜 수 있습니다.

앰플리코로 알려진 표적 서열은 "프라이머"로 알려진 뉴클레오티드의 두 개의 짧은 스트레칭을 사용하여 DNA 템플릿으로부터 증폭된다. 상보핵산 결합의 높은 특이성 때문에, 프라이머는 매우 구체적인 관심 서열의 표적 증폭을 허용한다. 관심 있는 유기체로부터 독특한 서열또는 서열의 독특한 조합을 증폭시키는 프라이머를 설계함으로써, PCR은 복잡한 환경 샘플에 존재하는 모든 유전 물질 들 사이에서 그 유기체의 DNA의 존재를 차별화적으로 검출하는 데 사용될 수 있다.

각 PCR 주기는 3단계로 나뉩니다. 첫 번째, "데나포화"로 알려진, 일반적으로 92 °C 이상 설정 하 고 약 30 s 지속. 부인은 DNA 분자를 단일 가닥으로 분해하여 증폭 반응을 진행하는 것을 허용하는 데 사용됩니다.

제2상 "어닐링"은 두 프라이머의 용융 온도보다 2~3°C 낮게 설정되며, 보통 50~65°C 사이이며 약 30초동안 지속된다. 용융 온도는 이중 좌초 된 DNA 분자의 50 %가 단일 가닥으로 분리되어 있으므로 어닐링 단계는 프라이머가 DNA 템플릿의 대상 부위에 결합 할 수 있게합니다.

PCR 사이클의 제3단계는 DNA 폴리머라제가 프라이머 템플릿 이중에 결합하고 새로운 가닥의 합성을 촉매할 때 "신장" 또는 "확장"이다. 가장 일반적으로 사용되는 PCR 폴리머라제, Taq에 대해 72°C로 설정하면 이 단계의 지속 시간은 앰플리콘의 길이에 따라 달라지며, 보통 500개의 베이스페어당 30s이다. 각 주기 후에, 증폭된 DNA는 다시 한번 변성되고 PCR 제품의 양이 기하급수적으로 증가하는 이끌어 내는 새로운 템플릿으로 봉사합니다.

반응이 완료되면 PCR 제품은 일반적으로 중합체 아가로즈로 만들어진 "젤"의 크기로 해결할 수 있으며, 이는 전기전주로 알려진 공정이다. 전기장은 젤 전체에 적용되고 DNA 분자의 중추에 있는 음전하로 인해 필드의 양수 끝으로 이동하게 됩니다. 일반적으로 말하자면, 더 큰 선형 DNA 분자는 젤 매트릭스를 통과하는 데 더 오래 걸릴 것입니다.

이제 PCR의 작동 방식을 이해하게 되었으므로 환경 샘플에서 미생물을 식별하는 데 반응을 어떻게 사용할 수 있는지 살펴보겠습니다.

먼저 처리할 샘플 수에 따라 필요한 각 시약의 볼륨과 파이펫팅 오류를 고려하여 10%를 추가로 계산합니다. 대상 영역을 포함하는 양수 제어 템플릿을 포함하여 반응이 작동하는지 확인해야 합니다. 뿐만 아니라 어떤 반응 구성 요소의 오염을 배제하기 위해 DNA 템플릿이 포함되어 있지 않은 부정적인 제어. Taq 폴리머라제 효소를 얼음 위에 보관하고, 오염을 방지하기 위해 지정된 라미나르 유동 후드에서 실온에서 나머지 시약 및 DNA 샘플을 해동하십시오.

모든 시약이 해동되면, 각 시약의 계산된 부피를 낮은 결합 미세 분리 튜브에 추가하여 시약 "마스터 믹스"를 구성하여 분자의 흡착으로 인한 시약 량의 불일치를 최소화합니다. 추가하기 전에 각 시약마다 부드럽게 소용돌이와 원심분리기를 넣습니다. 마스터 믹스가 준비되면, 소용돌이혼합하여 원심분리로 수집합니다.

8튜브 PCR 스트립에 레이블을 지정하여 컨트롤을 포함하여 각 샘플에 대해 하나의 튜브를 지정합니다. 스트립의 각 튜브에 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 분배합니다. 그런 다음 각 DNA 샘플을 각 튜브에 추가합니다.

스트립 캡을 스트립 튜브에 단단히 고정시키고 원심분리기를 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기에 간략하게 배치합니다. 그런 다음 튜브를 열순환기로 배치하고 적절한 PCR 프로그램에 따라 반응을 실행합니다.

PCR이 실행되는 동안 PCR 제품의 전기 전에 대한 아가로즈 젤을 준비하십시오. 예상 된 크기에 따라 PCR 제품을 해결할 수있는 농도가있는 젤에 적합한 양의 아가로즈 파우더를 계량하십시오. 아가로즈를 125mL 플라스크에 넣은 다음 젤 주조의 부피에 따라 적절한 양의 젤 러닝 버퍼를 플라스크에 넣고 혼합하여 소용돌이를 가세요. 아가로즈 용액을 고출력으로 1분간 전자레인지에 돌리면 됩니다. 완료되면 플라스크를 소용돌이쳐 아가로즈가 완전히 용해되었는지 확인하고 필요한 경우 30초 단위로 마이크로웨이브를 반복합니다.

플라스크에 캡을 단단히 고정하고, 흐르는 차가운 물 에서 플라스크를 소용돌이시켜 아가로즈 용액을 50 °C로 냉각시하십시오. 식으면 아가로즈에 에디듐 브로마이드 1 μL을 추가합니다. 에티듐 브로마이드는 잠재적으로 발암성이기 때문에 고글, 실험실 코트 및 에티듐 브로마이드 내성 장갑과 같은 개인 보호 장비를 착용하십시오.

아가로즈 용액을 전기전도 젤 주조 트레이에 붓고, 기포가 아가로즈 내에 갇혀 있지 않도록 합니다. 필요한 수의 우물이 있는 빗을 솔루션에 넣습니다. 젤을 실온에서 20~30분 동안 방치하여 고화시십시오. 젤이 설정되면 빗을 조심스럽게 제거하여 그 과정에서 젤을 찢지 않도록하십시오.

고화된 젤을 전기전도 챔버에 넣습니다. 젤이 잠길 때까지 LB 버퍼를 챔버에 추가합니다. 파라필름의 조각에, 파이펫은 PCR 제품의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리의 "스팟". 온도 순환기에서 완성된 반응으로 PCR 튜브를 검색합니다. 간단한 원심분리를 통해 PCR 튜브의 응축수를 수집하고 각 샘플의 8 μL을 파라필름에 추가합니다. PCR 제품의 각 지점에 10배 적재 염료 2μL을 추가하여 염료의 최종 농도가 2배되도록 합니다.

아가로즈 젤의 지정된 우물에 샘플과 사다리를 적재하고 젤을 찌르지 않도록 주의하십시오. 적재가 완료되면, 전기 전도챔버에 뚜껑을 착용하고 전극을 전원 공급 장치에 연결합니다. DNA는 음전하로 충전되고 양극쪽으로 이동하기 때문에, 우물이 음극에 가까운 쪽에 있는지 확인하십시오. 전원 공급 장치를 켜고 사용되는 전기 전광챔버의 크기와 완충 시스템의 크기에 적합한 전압으로 설정합니다. 전기 전도를 "실행"으로 설정합니다. 전기전도가 제대로 진행되면 챔버의 측면을 위로 이동하는 작은 기포가 관찰됩니다.

염료 전면이 젤 아래로 충분히 진보되면 전원 공급 장치를 끕니다. 젤을 젤 이미저로 조심스럽게 운반하여 전기 전광 제품을 시각화합니다. 보호 보호막을 사용하면 자외선을 켜고 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다. 대역의 위치를 분석하여 환경 샘플에 관심 있는 종의 존재를 나타내는 예상 패턴과 일치하는지 확인합니다.

이제 PCR이 어떻게 수행되는지 보았으니, 환경에 관심이 있는 미생물을 검출하기 위해 적용되는 다양한 방법을 살펴보겠습니다.

PCR 기반 환경 미생물 검출의 한 가지 사용은 "뇌 먹는 아메바" Naegleria fowleri,담수체에서 발견되는 단세포 유기체 및 종종 치명적인 인간 신경계를 공격할 수 있는 무염 수영장과 같은 질병을 일으키는 유기체를 식별하는 것입니다. 물 샘플 또는 의심되는 환자의 뇌척수액에 이 치명적인 미생물의 존재는 아메바의 게놈에 있는 독특한 DNA 순서를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR를 능력을 발휘해서 시험될 수 있습니다.

PCR 기반 미생물 식별을 위한 또 다른 응용 프로그램은 공중 위생 감시 및 질병 발발 조사의 일환으로, 음식 시설의 부근에 붙잡힌 파리에 있는 병원성 박테리아의 존재를 시험하는 것입니다.

여기서, 조사원은 살모넬라와 리스테리아와같은 병원성 박테리아의 존재를 찾아, 먼저 바디 표면과 파리의 소화 운하 모두에서 박테리아를 격리하고, 다음 관심의 이 종을 위해 풍부하게 종 특정 문화 조건을 사용하여. 배양된 박테리아로부터 DNA를 추출한 후, 시판되는 종별 검출 PCR 키트는 그들의 정체성을 테스트하는 데 사용되었습니다.

마지막으로, 주요 공중 위생 관심사를 제시하는 황색포도상구균과같은 항생제 저항하는 병원성 박테리아의 다른 긴장은, PCR로 확인되고 분화될 수 있습니다.

이 예에서, 연구원은 임상 견본에서 격리되고 배양한 S. 아우레우스, 그 때 세균성 식민지에서 DNA를 추출하고 PCR를 수행했습니다. 여기서 증폭 반응은 "멀티플렉스"였으며, 이는 세균 게놈의 다른 독특한 영역을 대상으로 하는 다중 프라이머 세트가 동일한 반응으로 결합되었다는 것을 의미합니다. 개별 프라이머 세트는 PCR 제품이 일부 균주의 DNA에서 유래하지만 다른 균주의 DNA에서 발생하도록 설계되었으므로 조합하여 각 변형에 대해 독특한 제품 밴드 패턴이 관찰되었습니다.

PCR 기반 미생물 검출에서 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 우리는 폴리머라제 연쇄 반응의 원리를 살펴보았습니다. 환경 미생물에서 추출한 DNA에 대한 PCR 을 수행하기 위한 프로토콜; 마지막으로, 환경 또는 임상 샘플의 다른 유형에 관심있는 유기체를 테스트하기 위해이 기술의 몇 가지 특정 응용 프로그램. 시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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도 1에서,DNA 사다리(레인 1)는 PCR 제품의 대역에 대한 크기 및 대략적인 농도에 대한 기준을 제공한다. 음의 대조군(레인 2)은 어떤 유전 물질을 포함하지 않으며, 양극(차선 3)은 표적 대역의 크기와 위치를 나타내는 표적 DNA를 포함하는 것으로 알려진 템플릿으로부터 증폭된다. 샘플 4, 6, 8 및 9는 양성 대조군으로서 유사한 대역 패턴을 나타내므로 이러한 샘플이 표적 유전 물질을 함유하고 있음을 나타낸다. 이러한 샘플이 수득된 환경에서 유기체가 존재한다는 것을 유추할 수 있다.

Figure 1
그림 1. 전기 전광 다음 아가로즈 젤에 밴드를 시각화.

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Applications and Summary

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PCR은 환경에서 병원균의 존재 또는 부재를 신속하게 결정하기 위해 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 뇌를 먹는 아메바, Naegleria fowleri에 특이적인 프라이머는 DNA를 증폭시키고 유기체가 샘플에 존재하는 경우 젤에 강한 밴드를 생성합니다. 단일 유기체가 주요 관심사가 아니라 다양한 유기체로부터 독소 생산과 관련된 유전자인 경우, PCR은 이러한 특정 유전 물질의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수 있다.

PCR은 또한 실험실에서 환경 미생물을 분석할 때 확인 절차로 사용될 수 있습니다. 배양 방법이 환경 샘플에 존재하는 특정 유기체를 구별할 수 없는 경우 PCR은 후보 미생물을 구체적으로 구별하는 데 사용될 수 있습니다.

기존의 PCR은 특정 실험 목적을 위해 여러 가지 방법으로 수정될 수 있습니다. PCR은 역전사 단계(RT-PCR)에 결합하여 단일 좌초 RNA 템플릿을 분석하는 데 사용될 수 있다. 부재대 존재의 결정 외에도 정량적 PCR(qPCR)은 특정 DNA에 대한 농도를 측정할 수 있다.

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Transcript

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