Overview
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner
Lo spettro della ricerca in microbiologia ambientale è ampio per portata e potenziale applicativo. Sia che il lavoro sia su scala di banco con isolati batterici noti, o sul campo raccogliendo campioni di suolo o acqua contenenti isolati batterici sconosciuti, la capacità di discernere rapidamente e visivamente popolazioni di interesse coltivabili rimane di grande importanza per i microbiologi ambientali ancora oggi con l'abbondanza di tecniche molecolari disponibili per l'uso. Questo video dimostrerà una di queste tecniche, nota come colorazione di Gram.
Principles
La colorazione Gram è una tecnica di colorazione classica e importante che rimane ampiamente utilizzata dai microbiologi ambientali. Simile a una semplice macchia, consente di valutare la morfologia delle cellule batteriche(ad esempio,cocchi, bastoncelli, formatori di spore), dimensioni e disposizione(ad esempio,catene o grappoli). Inoltre, consente di differenziare i batteri in due gruppi distinti - Gram-negativi e Gram-positivi - in base alla composizione e alla struttura della parete cellulare (Figura 1).
La colorazione di Gram è un processo in più fasi. Prima della colorazione, uno striscio batterico viene preparato utilizzando una piastra, un'inclinazione o una coltura di brodo. La preparazione dello striscio viene asciugata e fissata su un vetrino pulito. Una macchia primaria di cristallo viola viene quindi applicata allo striscio fisso. Il viola cristallo è una macchia di base composta da ioni colorati caricati positivamente(cioè cromofori) che formano deboli legami ionici con gruppi funzionali caricati negativamente presenti nella parete cellulare batterica. Dopo aver risciacquo delicatamente il vetrino con acqua, viene applicato lo iodio di Gram e forma complessi insolubili con il viola cristallino nella parete cellulare. I complessi cristallo viola-iodio si legano ulteriormente con il peptidoglicano, un componente principale delle pareti cellulari batteriche. Dopo un secondo risciacquo con acqua, un agente decolorante viene brevemente applicato allo striscio. Per i batteri Gram-negativi, il complesso cristallo viola-iodio viene lavato via durante la fase di decolorazione, con i batteri Gram-positivi che mantengono la macchia viola. Un terzo e ultimo risciacquo con acqua è seguito da una controstain di safranina che colora i batteri Gram-negativi rosa o rosso.
Figura 1. Confronto della parete cellulare dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi.
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Procedure
1. Raccolta dei campioni
- Raccogliere il campione di terreno e trasportare al laboratorio per l'analisi microbica.
- In laboratorio, pesare un campione di 10 g utilizzando una bilancia analitica.
- Diluire il campione 1:10 in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (10 parti di terreno equivale a 5 parti di liquido acquoso) e vortice da miscelare(Figura 2,Fase 1).
- Eseguire successive diluizioni 1:10 fino ad almeno 10-5 g di terreno per mL e diluizioni selezionate a piastre di diffusione in repliche di due o tre su un mezzo agar a basso contenuto di nutrienti(ad esempio,R2A) (Figura 2, Passaggi 2-3).
- Incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente (Figura 2, Passo 4).
- Selezionare una o due colonie per l'isolamento e strisciare su piastre di agar fresche (Figura 3, Passaggi 1-3).
- Incubare le piastre striata per due o tre giorni a temperatura ambiente (Figura 3, Fase 4).
2. Preparazione di strisci batterici
- Osservare le piastre striate per le colonie isolate.
- Per preparare ogni preparazione dello striscio, immergere un ciclo di inoculazione nell'etanolo, sterilizzare a fiamma e posizionare da 1 a 2 cicli di acqua distillata sterile al centro di vetrini pre-puliti.
- Sterilizzare nuovamente il ciclo di inoculazione come descritto in precedenza. Una volta raffreddato, rimuovere una piccola quantità di coltura da una singola colonia isolata e mescolarla con le goccioline d'acqua sul vetrino (lo striscio dovrebbe assomigliare al latte scremato diluito). Il ciclo di inoculazione deve essere raffreddato prima dell'isolamento della colonia. Un ciclo troppo caldo causerà lo schizzo della colonia e / o del mezzo, che può portare all'aerosolizzazione dei batteri. Generalmente, quando il loop è troppo caldo per l'uso, si sentirà un suono "sissante" quando applicato all'agar o alla colonia. Il raffreddamento improprio del loop può anche comportare un trasferimento da coltura a diapositiva meno efficiente e una distorsione della morfologia cellulare.
- Stendere lo striscio sulla superficie del vetrino di circa 2,5 cm x 2,5 cm e lasciarlo asciugare all'aria. È importante che l'essiccazione all'aria avvenga in condizioni di flusso laminare. Le diapositive non devono essere asciugate in modo da non interrompere lo striscio. Inoltre, i vetrini non devono essere essiccati a fiamma, al fine di mantenere la morfologia cellulare.
- Dopo l'asciugatura, il calore fissa lo striscio facendo passare rapidamente la diapositiva attraverso una fiamma 2-3x. Il vetrino non deve essere tenuto fermo nella fiamma, per evitare distorsioni della morfologia cellulare e/o danni al vetrino.
3. Colorazione del grammo
- Fissare la diapositiva a un'estremità usando una molletta pulita.
- Coprire lo striscio con viola cristallo (macchia primaria) e tenere premuto per 2 o 3 minuti.
- Lavare accuratamente lo scivolo con acqua distillata. Il flusso d'acqua non deve essere diretto verso lo striscio per evitare danni e/o distacchi dal vetrino.
- Coprire lo striscio con lo iodio di Gram e tenere premuto per 2 minuti, quindi risciacquare delicatamente lo scivolo con acqua.
- Decolorare lo striscio usando il 95% di etanolo fino a quando la macchia non si lava più dal vetrino (questo di solito non richiede più di 20 s a seconda dello spessore dello striscio), quindi risciacquare immediatamente con acqua distillata. Questo passaggio è fondamentale per evitare la decolorazione eccessiva della diapositiva, che può portare a una falsa designazione della macchia di Gram(cioè grammo-variabile).
- Aggiungere la controstain (safranin) allo striscio e tenere premuto per 30 s. Quindi risciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata e asciugare con carta assorbente.
4. Osservazione microscopica dei vetrini
- Osservare le diapositive utilizzando obiettivi bassi(ad esempio,4X o 10X), ad alta secchezza(ad esempio,40X) e ad immersione in olio (100X). Per l'immersione in olio, aggiungere l'olio direttamente allo striscio.
- Per i risultati rappresentativi dei batteri del suolo Gram-positivi e Gram-negativi, vedere le figure 4 e 5.
Figura 2. Tecnica di diluizione e Spalmatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Isolamento della colonia utilizzando la tecnica streak plate.
Figura 4. Batterio del suolo Gram-positivo Staphylococcus aureus.
Figura 5. Batterio del suolo Gram-negativo Escherichia coli.
La colorazione di Gram consente una rapida visualizzazione della morfologia batterica e un'ampia distinzione cellulare da una vasta gamma di campioni ambientali. Per macchiare i batteri, uno striscio uniforme viene applicato su un lato di vetro e lasciato asciugare. Dopo aver fissato a caldo lo striscio, viene applicato il viola cristallo.
Un agente decolorante risciacqua via il viola cristallino dalle cellule Gram-negative, ma non dalle cellule Gram-positive. Un secondo colorante, tipicamente safranina, viene utilizzato come macchia di sfondo per visualizzare le cellule Gram-negative. Una volta colorate, le cellule possono essere valutate per la morfologia, le dimensioni e la disposizione delle cellule, come catene o cluster.
Questo video dimostrerà come preparare un campione ambientale, isolare le specie batteriche ivi trovate ed eseguire una macchia di Gram sulle colonie isolate
La colorazione di Gram consente la categorizzazione della maggior parte dei batteri in due ampie classi strutturali: Gram-positivo e Gram-negativo. Mentre entrambe le classi hanno una membrana plasmatica fosfolipidica sottostante, la struttura della parete cellulare varia notevolmente. La parete cellulare Gram-positiva è composta principalmente da uno spesso strato di peptidoglicano, che è un polimero costituito da zuccheri e amminoacidi. Le pareti cellulari Gram-negative hanno uno strato più sottile di peptidoglicano, inserito tra una seconda membrana lipidica. Questa membrana esterna contiene tipicamente lipopolisaccaridi.
Il viola cristallino caricato positivamente si lega debolmente alla parete cellulare batterica caricata negativamente. Lo iodio di Gram forma un complesso insolubile con il colorante viola cristallino, fissandolo così nella parete cellulare.
Durante la fase di decolorazione, il peptidoglicano nelle cellule Gram-positive viene disidratato, facendolo contrarre e intrappolare i complessi cristallo viola-iodio. Nelle cellule Gram-negative, l'agente decolorante compromette la membrana esterna, aumentandone la porosità. Ciò consente di lavare via i complessi cristallo viola-iodio.
Ora che hai capito i principi alla base dei batteri del suolo che colorano Gram, vediamo il processo eseguito sui batteri del suolo in laboratorio.
Dopo aver raccolto un campione di terreno sul campo, portalo in laboratorio per l'analisi. Raffinare il campione con un setaccio e pesare 10 g del terreno setacciato utilizzando una bilancia analitica.
Diluire il campione in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato e vortice per mescolare. Eseguire ulteriori da 1 a 10 diluizioni, vorticando tra ogni diluizione. Trasferire aliquote di almeno 3 diluizioni successive, su piastre di acarosio a basso contenuto di nutrienti replicate.
Dopo la sterilizzazione a fiamma di etanolo e il raffreddamento di un'asta di vetro piegata picchiettando il supporto, distribuire il campione sulla superficie delle piastre. Incubare le piastre a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione per 3-5 giorni, selezionare la diluizione più alta con 30-300 colonie discrete. Con un ciclo di inoculazione sterile, selezionare le colonie di interesse per l'isolamento.
Striscia la colonia su una sezione di un piatto fresco. Sterilizzando l'anello tra le strisce, fare strisce successive in uno schema a zig-zag su ogni sezione della piastra per consentire il successivo isolamento di singole colonie discrete. Incubare le piastre per 1 o 2 giorni a temperatura ambiente.
Per iniziare la preparazione di strisci batterici, attaccare una clip a una diapositiva di vetro pre-pulita per facilitare la manipolazione. Per ogni striscio batterico, pulire e sterilizzare a fiamma un ciclo inoculante. Posizionare 2 loopful di acqua distillata sterile al centro dello scivolo.
Dopo aver sterilizzato nuovamente il cappio, rimuovere una piccola quantità di coltura da una colonia isolata e mescolare con l'acqua sullo scivolo. È importante raffreddare il ciclo prima di toccare la cultura toccando più volte una porzione non inoculata di agar. Lo striscio dovrebbe assomigliare al latte diluito. Lasciare asciugare la diapositiva a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, il calore fissa lo striscio facendolo passare rapidamente attraverso una fiamma.
Una volta asciutto, pipettare il cristallo viola sullo striscio e lasciare riposare per 2 - 3 minuti. Risciacquare accuratamente il vetrino con acqua distillata puntando il flusso diretto verso la parte superiore del vetrino, consentendo all'acqua di scorrere delicatamente verso il basso. Non puntare il flusso d'acqua direttamente sullo striscio.
Coprire la diapositiva con lo iodio di Gram. Dopo 2 minuti, risciacquare delicatamente con acqua distillata. Decolorare il vetrino con etanolo al 95% fino a quando la macchia non si lava più via. Risciacquare immediatamente con acqua distillata. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio.
Aggiungere la safranina come contromacchia allo striscio per 30 s. Questo macchierà tutte le cellule Gram-negative presenti. Risciacquare delicatamente con acqua distillata e asciugare con carta assorbente. Osservare il vetrino risultante con un microscopio. Usa prima un obiettivo a bassa potenza per effettuare regolazioni grossolane e trova una porzione ideale dello striscio prima di passare al campo visivo più piccolo degli ingrandimenti più elevati.
Dopo un'ulteriore creazione di immagini e la regolazione dello striscio con un obiettivo di media potenza, aggiungere olio di immersione direttamente allo striscio. L'olio è necessario per obiettivi ad alta potenza che forniranno le migliori micrografie. I batteri Gram-positivi appariranno di colore blu o viola, mentre le cellule Gram-negative saranno rosse o rosa. Oltre alla struttura, la forma e la disposizione della parete cellulare sono chiarite dalle micrografie risultanti.
La capacità della colorazione di Gram di studiare qualitativamente i batteri è importante per una vasta gamma di campi scientifici.
Il suolo è solo una delle fonti ambientali da cui i batteri possono essere isolati e analizzati. Per l'acqua potabile, la preparazione del campione deve essere modificata. Campioni di acqua del rubinetto possono essere prelevati da un rubinetto e placcati su mezzi di crescita che facilitano la crescita di diverse colonie batteriche eterotrofiche. Dopo la placcatura su un mezzo come R2A, il processo è quasi identico alla procedura del terreno.
Per alcune tecniche di identificazione batterica, i parametri dipendono dal tipo di parete cellulare dei batteri di interesse. In questo esempio, il sangue di un paziente settico è stato testato ed è stato trovato che ospitava batteri Gram-positivi.
Con queste informazioni, sono state scelte sonde di acido nucleico peptidico specie-specifiche che si sarebbero legate all'rRNA delle cellule. Queste sonde erano legate a coloranti fluorescenti che venivano utilizzati per identificare le specie presenti.
A causa delle differenze fondamentali nella struttura cellulare Gram-positiva e negativa, i batteri hanno risposte uniche ad altri composti oltre al cristallo viola. Questo esperimento ha cercato di isolare clostridium difficile,un batterio Gram-positivo, da campioni fecali. La cicloserina, che inibisce la crescita delle cellule Gram-negative, è stata aggiunta alla piastra di agar. Le cellule Gram-positive che sono cresciute sulla piastra sono state ulteriormente isolate tramite altri metodi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla colorazione di Gram per studi ambientali. Ora dovresti capire i vantaggi del processo e come eseguire la tecnica e utilizzare i risultati. Grazie per l'attenzione!
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Applications and Summary
La macchia di Gram è utilizzata nei numerosi sottocampi della microbiologia sia ambientale che clinica. Gli scienziati della qualità dell'acqua possono utilizzare la macchia di Gram come strumento di conferma per il rilevamento di batteri fecali nei campioni d'acqua. Gli isolati batterici dei suoli sono colorati di Gram per caratterizzare ulteriormente le comunità del suolo coltivabili. Per i microbiologi ambientali, la colorazione gramino aiuta nella categorizzazione delle popolazioni batteriche in base alla struttura della parete cellulare. Questo, a sua volta, fornisce informazioni sulla capacità generale di una determinata comunità microbica di resistere all'essiccazione e ad altri fattori di stress ambientale. La conoscenza della designazione della colorazione Gram è anche importante nella ricerca e nello sviluppo di disinfettanti e altri antimicrobici, poiché i batteri Gram-positivi tendono ad essere più resistenti all'inattivazione da parte di particolari sostanze chimiche rispetto ai batteri Gram-negativi.
Per le applicazioni di microbiologia clinica, la macchia di Gram viene utilizzata per confermare l'identità degli agenti batteriologici insieme ai metodi diagnostici tradizionali. È anche di grande aiuto quando la coltivazione è fallita o non è un'opzione. La colorazione gram di campioni clinici può rivelare la presenza di agenti eziologici che potrebbero non essere stati osservati altrimenti.
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