Overview
출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
데모 저자: 루이사 이크너
환경 미생물학에 있는 연구의 스펙트럼은 범위 및 응용 잠재력에 광범위합니다. 이 작업이 알려진 세균 분리재와 벤치 스케일이든, 알 수 없는 세균 분리를 포함하는 토양 또는 물 샘플을 수집하는 현장에서, 관심있는 컬터링 집단을 신속하고 시각적으로 분별할 수 있는 능력은 오늘날에도 사용할 수 있는 풍부한 분자 기술로 환경 미생물학자에게 큰 수입의 남아 있습니다. 이 비디오는 Gram 염색으로 알려진 하나의 기술을 보여줍니다.
Principles
그램 얼룩은 환경 미생물학자에 의해 널리 사용되는 고전적이고 중요한 염색 기술입니다. 간단한 얼룩과 마찬가지로 세균세포형태(예:코치, 로드, 포자-전자), 크기 및배열(예:체인 또는 클러스터)의 평가를 허용합니다. 또한, 세포벽 조성 및구조(도 1)에따라 박테리아를 두 가지 원리구별 군(Gram-negative 및 Gram-positive)으로 분화할 수 있다.
그램 염색은 다단계 과정입니다. 염색하기 전에 접시, 경사 또는 국물 배양을 사용하여 세균 얼룩이 준비됩니다. 얼룩 준비는 건조하고 깨끗한 유리 슬라이드에 고정됩니다. 크리스탈 바이올렛의 기본 얼룩은 고정 된 얼룩에 적용됩니다. 크리스탈 바이올렛은 세균세포벽에 존재하는 음전하 기능성 그룹과 약한 이온 결합을 형성하는 양전하 유색이온(즉 크로모포레스)으로 구성된 기본 얼룩이다. 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구고 나서 그램의 요오드가 적용되고 세포 벽에 크리스탈 바이올렛이 있는 용해성 복합체를 형성합니다. 크리스탈 바이올렛 요오드 복합체는 세균성 세포벽의 원리 성분인 펩티도글리칸과 더욱 결합합니다. 두 번째 물 헹구기 에 이어 탈색제는 얼룩에 간략하게 적용됩니다. 그람 음성 박테리아의 경우, 수정 보라색 요오드 복합체는 변색 단계 동안 씻어 내고 그램 양성 박테리아가 보라색 얼룩을 유지합니다. 세 번째이자 마지막 물 헹구는 다음 그람 음성 박테리아를 분홍색또는 빨간색으로 색칠하는 사프란의 카운터스테인이 뒤따릅니다.
그림 1. 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 세포 벽의 비교.
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Procedure
1. 샘플 수집
- 미생물 분석을 위해 토양 샘플을 수집하고 실험실로 이송합니다.
- 실험실에서 분석 균형을 사용하여 10g 샘플의 무게를 측정합니다.
- 시료를 1:10으로 95mL의 인산염 완충식식염수(10개 부품 토양은 5부 수성 액체에 해당), 및 혼합하는소용돌이(도 2,1단계)를 희석시켰다.
- 후속 1:10 희석은 mL당 최소 10-5g의 토양까지 수행하며, 낮은 영양통조매(예: 2, 단계 2-3)에 2~3개의 복제로 선택된 희석을 수행한다.
- 상온에서 1 주일 동안 플레이트를 배양하십시오(그림 2,4 단계).
- 고립을 위해 하나 또는 두 개의 식민지를 선택하고 신선한 한천 접시에 줄무늬(그림 3,단계 1-3).
- 실온에서 2~3일 동안 줄무늬 플레이트를 배양한다(그림3,4단계).
2. 세균 얼룩의 준비
- 고립 된 식민지에 대한 줄무늬 플레이트를 관찰.
- 각 얼룩 준비를 준비하려면 에탄올에 접종 루프를 담그고, 화염 살균을 하고, 멸균 된 증류수 1~2루를 미리 세척한 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다.
- 이전에 설명한 대로 접종 루프를 다시 살균합니다. 냉각되면, 하나의 고립 된 식민지에서 문화의 작은 금액을 제거하고 슬라이드에 물방울과 혼합 (얼룩은 희석 탈지 우유를 닮아야한다). 식민지 격리 전에 접종 루프를 냉각해야 합니다. 너무 뜨겁게 된 루프는 식민지 및/또는 중간체가 튀어 나와 박테리아의 에어로졸화로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 루프가 너무 뜨거워서 사용이 너무 뜨거워지면 한천이나 식민지에 적용될 때 "히싱" 소리가 들립니다. 루프의 부적절한 냉각은 또한 덜 효율적인 배양-슬라이드 전송 및 세포 형태의 왜곡을 초래할 수 있습니다.
- 약 2.5cm x 2.5cm의 슬라이드 표면에 얼룩을 퍼뜨리고 공기 건조를 허용합니다. 공기 건조는 라미나르 유량 조건에서 발생하는 것이 중요합니다. 미끄럼이 얼룩을 방해하지 않도록 슬라이드가 건조해서는 안됩니다. 또한, 슬라이드는 세포 형태를 유지하기 위해, 화염 건조해서는 안됩니다.
- 건조 후, 열은 2-3 x 불꽃을 통해 신속하게 슬라이드를 전달하여 얼룩을 고정합니다. 슬라이드는 세포 형태의 왜곡 및 /또는 유리 슬라이드의 손상을 방지하기 위해, 화염에 고정 개최해서는 안된다.
3화 그램 염색
- 깨끗한 옷핀을 사용하여 한쪽 끝에서 슬라이드를 고정하십시오.
- 크리스탈 바이올렛 (기본 얼룩)으로 얼룩을 덮고 2 ~ 3 분 동안 유지하십시오.
- 슬라이드를 증류수로 조심스럽게 씻으십시오. 유리 슬라이드의 손상 및/또는 분리를 방지하기 위해 물 스트림은 얼룩을 향해서는 안됩니다.
- 그람의 요오드로 얼룩을 덮고 2분 동안 누은 다음 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구십시오.
- 얼룩이 더 이상 슬라이드에서 세싱되지 않도록 95 %의 에탄올을 사용하여 얼룩을 탈색 (이것은 일반적으로 얼룩의 두께에 따라 20 s 이상 걸리지 않습니다), 즉시 증류수로 헹구십시오. 이 단계는 슬라이드를 변색하는 것을 피하기 위해 매우 중요하며, 이는 잘못된 Gram 얼룩지정(즉, 그램 변수)으로 이어질 수 있습니다.
- 카운터스테인(사프란)을 얼룩에 넣고 30s를 잡습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 부드럽게 헹구고 흡수성 종이를 사용하여 건조하게 헹구십시오.
4. 슬라이드의 현미경 관찰
- 낮은(예:4X 또는 10X), 고건조(예: 40X), 오일 침지(100X) 목표를 사용하여 슬라이드를 관찰한다. 오일 침수의 경우 오일을 얼룩에 직접 추가합니다.
- 그람 양성 및 그람 음성 토양 박테리아의 대표적인 결과는 그림 4 및 5를참조하십시오.
그림 2. 희석 및 확산 도금 기술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 식민지 격리.
그림 4. 그램 양성 토양 박테리아 황색포도상구균.
그림 5. 그람 음성 토양 박테리아 에체리치아 대장균.
그램 염색은 광범위한 환경 샘플에서 세균 형태와 광범위한 세포 구별을 빠르게 시각화 할 수 있습니다. 박테리아를 더럽기 위해, 균일 한 얼룩이 유리 측에 적용되어 건조 할 수 있습니다. 얼룩을 가열 한 후, 크리스탈 바이올렛이 적용됩니다.
탈색제는 그람 음성 세포에서 크리스탈 바이올렛을 씻어내지만 그람 양성 세포는 헹구지 않습니다. 두 번째 염료, 일반적으로 사프란, 그람 음성 세포를 시각화 하는 배경 얼룩으로 사용 됩니다. 일단 염색되면, 세포는 사슬 또는 클러스터와 같은 세포 형태, 크기 및 배열을 위해 평가될 수 있습니다.
이 비디오는 환경 샘플을 준비하고, 그 안에 있는 세균종을 격리하고, 고립된 식민지에 그램 얼룩을 수행하는 방법을 보여줍니다.
그램 염색은 대부분의 박테리아를 두 개의 광범위한 구조 클래스로 분류할 수 있습니다: 그램 양성 및 그람 음성. 두 클래스 모두 기본 인지질 혈장 멤브레인을 가지고 있지만, 세포 벽의 구조는 크게 다릅니다. 그람 양성 세포벽은 주로 설탕과 아미노산으로 구성된 폴리머인 펩티도글리칸의 두꺼운 층으로 구성됩니다. 그람 음성 세포벽은 두 번째 지질 막 사이에 끼어 있는 펩티도글리칸의 얇은 층을 갖는다. 이 외부 막은 전형적으로 리포폴리사카라이드를 포함합니다.
양전하 의 결정 보라색은 음전하 세균 세포벽에 약하게 결합합니다. 그람의 요오드는 크리스탈 바이올렛 염료로 용해성 복합체를 형성하여 세포벽에 고정시합니다.
탈색 단계 동안, 그람 양성 세포의 펩티도글리칸은 탈수되어 결정 보라색 요오드 복합체를 수축시키고 트랩합니다. 그램 음성 세포에서 탈색제는 외부 막을 손상시켜 다공성을 증가시킵니다. 이를 통해 크리스탈 바이올렛 요오드 단지를 씻어내게 됩니다.
이제 Gram 염색 토양 박테리아의 원리를 이해하게 되었으므로 실험실에서 토양 박테리아에서 수행되는 과정을 살펴보겠습니다.
현장에서 토양 샘플을 수집한 후 분석을 위해 실험실로 가져 오십시오. 체로 샘플을 정제하고 분석 균형을 사용하여 체질 토양의 10g의 무게를 측정합니다.
시료를 인산염 완충식식염과 소용돌이의 95mL로 희석하여 혼합합니다. 희석1-10희석을 추가로 수행하여 희석할 때마다 소용돌이를 가합니다. 적어도 3 개의 연속 희석의 알리쿼트전달, 낮은 영양 아가로즈 플레이트를 복제합니다.
에탄올 화염 살균 및 미디어에 눌러 구부러진 유리 막대의 냉각에 따라, 플레이트의 표면에 샘플을 확산. 상온에서 플레이트를 배양합니다. 3~5일 동안 인큐베이팅한 후 30~300개의 개별 콜로니를 사용하여 가장 높은 희석을 선택합니다. 멸균 접종 루프를 사용하면 격리에 대한 관심있는 식민지를 선택합니다.
식민지를 신선한 접시의 한 부분에 줄무늬. 줄무늬 사이의 루프를 살균하고, 플레이트의 각 섹션에 지그재그 패턴으로 연속적인 줄무늬를 만들어 이산 단일 콜로니의 후속 격리를 허용합니다. 상온에서 1~2일 동안 플레이트를 배양합니다.
세균 얼룩의 준비를 시작하려면, 취급의 용이성을 위해 미리 청소 유리 슬라이드에 클립을 부착. 각 세균 성 얼룩에 대 한, 깨끗 하 고 염증 루프를 살균. 2 루프한물을 미끄럼중앙에 놓습니다.
루프를 다시 살균한 후, 고립된 식민지에서 소량의 배양을 제거하고 슬라이드의 물과 섞는다. 한천의 단발되지 않은 부분을 여러 번 눌러 문화를 만지기 전에 루프를 식히는 것이 중요합니다. 얼룩은 희석 된 우유와 유사해야합니다. 실온에서 슬라이드를 건조시키십시오. 건조 후, 열은 신속하게 불꽃을 통과하여 얼룩을 수정합니다.
일단 건조하면, 피펫 크리스탈 바이올렛이 얼룩에 바르고 2 - 3 분 동안 앉게하십시오. 슬라이드 의 상단을 향해 직접 흐름을 목표로 하여 증류수로 슬라이드를 조심스럽게 헹구어 물이 부드럽게 아래로 흘러 내리도록 합니다. 물 흐름을 얼룩에서 직접 조준하지 마십시오.
그람의 요오드로 슬라이드를 덮습니다. 2분 후 증류수로 부드럽게 헹구십시오. 얼룩이 더 이상 씻어 내지 않고 95%의 에탄올로 슬라이드를 탈색합니다. 증류수로 즉시 헹구는 다. 이렇게 하면 얼룩을 과도하게 색색화할 수 있습니다.
30 s에 대 한 얼룩에 카운터 얼룩으로 사프란을 추가 합니다. 이것은 존재하는 어떤 그람 음성 세포든지 얼룩질 것입니다. 증류수로 부드럽게 헹구고 흡수성 종이로 빗자루를 건조시다. 현미경으로 결과 슬라이드를 관찰합니다. 먼저 저전력 목표를 사용하여 거친 조정을 하고 더 높은 배율의 더 작은 시야로 이동하기 전에 얼룩의 이상적인 부분을 찾습니다.
중간 전력 목표로 얼룩을 추가로 이미징하고 조정한 후 얼룩에 직접 침지 오일을 추가합니다. 최고의 현미경 을 제공하는 고전력 목표에 는 오일이 필요합니다. 그람 양성 박테리아는 파란색 또는 보라색으로 표시되며 그람 음성 세포는 빨간색 또는 분홍색입니다. 세포벽 구조 외에도 결과 현미경 검사에서 모양과 배열이 해명됩니다.
질적으로 박테리아를 연구하는 그램 염색의 능력은 과학적인 필드의 넓은 범위에 중요합니다.
토양은 박테리아를 분리하고 분석할 수 있는 환경 공급원 중 하나일 뿐입니다. 식수의 경우 시료 준비를 수정해야 합니다. 수돗물의 샘플은 수도꼭지에서 그려질 수 있으며, 다양한 이종성 세균 성 식민지의 성장을 용이하게 성장 매체에 도금 할 수 있습니다. R2A와 같은 매체에 도금하면 토양 절차와 거의 동일합니다.
특정 세균 식별 기술의 경우, 파라미터는 관심 있는 박테리아의 세포벽 유형에 의존한다. 이 예에서, 정화조 환자의 혈액은 시험되었고 그람 양성 박테리아를 품고 있는 것으로 나타났습니다.
이 정보를 통해, 종별 펩티드 핵산 프로브는 세포의 rRNA에 결합할 수 있도록 선택되었다. 이 탐사선은 존재하는 종을 확인하기 위하여 이용된 형광염료에 묶여 있었습니다.
그람 양성 및 음성 세포 구조의 근본적인 차이 때문에 박테리아는 크리스탈 바이올렛 외에 다른 화합물에 대한 독특한 반응을 가지고 있습니다. 이 실험은 칼 샘플에서 그람 양성 박테리아인 클로스트리듐 디피실을분리하고자 했습니다. 그람 음성 세포의 성장을 억제하는 Cycloserine은 한천 판에 첨가되었습니다. 플레이트에서 자란 그램 양성 세포는 다른 방법을 통해 더 격리되었습니다.
환경 연구를 위해 Gram 염색에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 프로세스의 이점과 기술을 수행하고 결과를 활용하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Applications and Summary
Gram 얼룩은 환경 및 임상 미생물학 모두의 많은 하위 분야에서 사용됩니다. 수질 과학자들은 물 샘플에서 배설물 박테리아를 검출하기 위한 확인 도구로 그램 얼룩을 사용할 수 있습니다. 토양에서 세균 분리는 더 컬터 토양 지역 사회를 특성화하기 위해 그람 염색된다. 환경 미생물학자의 경우, Gram 얼룩은 세포벽 구조에 따라 세균 성 인구의 분류에 보조됩니다. 이것은 차례로, 탈수 및 그밖 환경 스트레스를 견딜 수 있는 주어진 미생물 지역 사회의 일반적인 기능에 관하여 정보를 제공합니다. 그람 얼룩 지정에 대한 지식은 그람 양성 박테리아가 그람 음성 박테리아보다 특정 화학물질에 의한 비활성화에 더 강한 경향이 있기 때문에 소독제 및 기타 항균제의 연구 및 개발에도 중요합니다.
임상 미생물학 응용 프로그램의 경우, Gram 얼룩은 전통적인 진단 방법과 함께 세균성 질환 제제의 신원을 확인하는 데 사용됩니다. 배양이 실패했거나 옵션이 아닐 때도 큰 도움이 됩니다. 임상 표본의 그램 염색은 그렇지 않으면 관찰되지 않았을 지도 모르다 에티오로학 에이전트의 존재를 밝힐 수 있습니다.
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