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Extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos
 
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Extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos

Overview

Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst

Todo laboratório precisa de padrões que rastreiem o desempenho, a precisão e a precisão de seus instrumentos ao longo do tempo para garantir que uma medição feita hoje seja a mesma de uma medição feita daqui a um ano(Figura 1). Como as normas devem testar o desempenho dos instrumentos durante um longo período de tempo, grandes volumes das normas são frequentemente exigidos. Muitos padrões químicos podem ser adquiridos de empresas científicas de varejo, como Sigma-Aldrich e Fisher. No entanto, alguns compostos que ocorrem na natureza e que são relevantes para estudos paleoclimáticos ainda não foram isolados e purificados para compra. Portanto, esses compostos precisam ser extraídos de amostras naturais, e devido aos grandes volumes de padrões exigidos, grandes volumes de sedimentos precisam ser extraídos. As extrações de solventes aceleradas (Dionex) e as extrações de sônica não são apropriadas para a extração de grandes volumes de sedimentos. Nestas circunstâncias, uma extração de Soxhlet é usada.

Figure 1
Figura 1. Esquema mostrando como o padrão químico rastreia o desempenho de um instrumento através do tempo. A linha tracejada representa uma relação 1:1 entre o valor aceito e medido (no instrumento) de uma variável. Cada estrela é uma medição semanal do padrão químico. Estrelas verdes representam padrões que são precisos. As estrelas vermelhas refletem aquelas que não são precisas indicando que o instrumento requer manutenção corretiva.

Principles

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A extração de Soxhlet é provavelmente a forma mais antiga de extração de matéria orgânica. Evidências arqueológicas da Mesopotâmia colocam o uso de um dispositivo semelhante a Soxhlet que utilizava água quente a ~3.500 a.C.1,2. Os Soxhlets modernos usam condensadores de vidro soprado sofisticados e solventes orgânicos neste método de extração "contínuo"(Figura 2). Solvente é refluxo de um frasco de fundo redondo para cima em um condensador com uma bobina de água fria recirculando. Quando o solvente gasoso entra em contato com a bobina, ela se condensa em uma câmara com um dedal de fibra de vidro segurando a amostra. Esta câmara é definida com um recirculador, e quando um certo volume é atingido (geralmente um volume grande o suficiente para submergir toda a amostra), a câmara é lavada de volta para o frasco de fundo redondo através de um sifão embutido, onde o extrato lipídudo se acumula enquanto o solvente se torna parte do próximo ciclo. Daí, o termo extração "contínua". A extração de soxhlet é frequentemente usada para a extração de amostras maiores (>10 g).

Figure 2
Figura 2. Um aparelho soxhlet.

A extração de soxhlet é um método de isolar compostos, como lipídios, de uma grande quantidade de material sólido com um volume relativamente pequeno de solvente.

Muitos dos compostos relevantes para estudos paleoclimáticos não estão disponíveis para compra de empresas científicas de varejo. As normas desses compostos devem, portanto, ser preparadas a partir de amostras naturais.

Grandes quantidades de padrão são necessárias para avaliar o desempenho de um instrumento ao longo do tempo. Para obter uma quantidade adequada de um biomarcador para a preparação padrão, um grande volume de sedimentos deve ser extraído.

O extrator Soxhlet, inventado na década de 1870 por Franz von Soxhlet, permite a extração automatizada em lote a partir de um sólido, aumentando a eficiência geral enquanto usa uma pequena quantidade de solvente.

Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ele ilustrará a extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos marinhos para uso na paleotermometria e introduzirá algumas outras aplicações da extração de Soxhlet na ciência e química da Terra.

Um conjunto típico usa um frasco de fundo redondo, um condensador de água fria, e o próprio aparelho Soxhlet. O sólido a ser extraído é colocado em um dedal na câmara central do aparelho. A extração é auxiliada pela adição de energia na forma de calor, conhecida como refluxo. O vapor solvente sobe através do caminho de destilação no aparelho Soxhlet para o condensador. Ao condensar, o solvente recolhe na câmara, dissolvendo parte do material orgânico no dedal. À medida que a câmara enche, o sifão também preenche. Quando o sifão está cheio, a solução flui de volta para o frasco. O nível da solução nunca excede a parte superior do dedal, então nenhum sólido entra no frasco.

O extrato lipíduo coleta continuamente no frasco, enquanto o solvente torna-se parte do próximo ciclo de extração. Assim, o ciclo pode se repetir indefinidamente sem perda de solvente.

A conservação do solvente, a natureza contínua da extração e a capacidade de acomodar grandes tamanhos de amostra torna a extração de Soxhlet ideal para isolar compostos orgânicos de grandes porções de material insolúvel.

Agora que você entende os princípios da extração de Soxhlet, vamos passar por um procedimento para a extração de Soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos.

Para este experimento, uma amostra de sedimentos marinhos em excesso de uma expedição de coring é usada. A amostra será congelada, esmagada e homogeneizada. Para obter mais instruções, consulte o vídeo desta coleção sobre Extração por Sonication.

Para se preparar para a extração, primeiro faça uma solução 9:1 de diclorometano para metanol. Esta solução será utilizada como solvente de extração e para lavar os vidros e instrumentos de laboratório.

Para remover contaminantes orgânicos, combustão o frasco de fundo redondo, aparelho Soxhlet, dedal de fibra de vidro e latas de pesagem por 6h a 550 °C. Lave um frasco de fundo redondo da solução DCM-metanol. Uma vez pronto para configurar a extração, enxágue uma espátula de laboratório e cinco a dez chips de ebulição com a solução de metanol DCM.

Para começar a construir o conjunto de extração, configure um manto de aquecimento em um capô de fumaça. Obtenha um condensador, uma suporte de suporte para garantir o frasco traseiro redondo, e o aparelho Soxhlet.

Tare uma lata de pesagem queimada. Com a espátula enxaguada com solvente, transfira aproximadamente 50 g de amostra para a lata de pesagem e registe a massa. Coloque o material no dedal de fibra de vidro queimado.

Em seguida, encha o frasco de fundo redondo e queimado um pouco mais da metade da solução de metanol DCM. Adicione os chips de ebulição lavados e coloque o frasco de fundo redondo no manto de aquecimento.

Em seguida, coloque o dedal da amostra aberto acabar na câmara do aparelho Soxhlet. Conecte o aparelho ao frasco de fundo redondo e aperte o aparelho no lugar.

Segure o condensador no topo do aparelho Soxhlet. Conecte a linha de água fria à porta inferior do condensador com um grampo de mangueira ou gravata zip. Conecte a linha de saída à porta superior do condensador e encaminhe-a para o ralo.

Ligue a água para o condensador e verifique o caminho de fluxo. Em seguida, ligue o manto de aquecimento e aqueça o solvente para o refluxo.

À medida que o solvente começa a condensar, certifique-se de que o condensado está pingando na câmara e que o extrato é siphoneed no frasco de fundo redondo. O solvente deve ficar em baixa fervura durante toda a extração.

Monitore o processo de extração e o fluxo de água do condensador até que a extração esteja completa. Em seguida, pare a extração desligando o manto de aquecimento. Uma vez que o extrato tenha esfriado, remova o aparelho condensador e soxhlet. Por fim, sele o frasco de fundo redondo contendo o extrato lipíduo total e armazene para posterior processamento.

A extração de soxhlet é frequentemente usada para análise química de uma amostra sólida, e também pode ser usada para preparação e purificação de reagentes.

A extração de soxhlet pode ser usada para detectar a presença de compostos de bifenil policlorados, ou PCBs, no ambiente. A eficiência de transferência de PCBs de peixes-presas para peixes predadores foi medida para obter mais informações sobre os riscos à saúde dos seres humanos e da vida selvagem por comer peixes contaminados. A extração de soxhlet de tecido de peixe permite a preparação de amostras para cromatografia gasosa e espectrometria de massa.

Compostos a serem introduzidos ao meio ambiente em grandes quantidades são analisados para a presença de PCBs. Biochar é um subproduto da pirólise da matéria orgânica que, quando adicionado ao solo, pode melhorar a qualidade do solo e captar poluentes. A validação dos métodos de produção de biochar para uso generalizado inclui a extração de Soxhlet para testar a presença de PCBs por cromatografia gasosa.

A extração de soxhlet também pode ser usada para purificar um sólido pela extração de compostos indesejados. Os ácidos graxos de cadeia longa foram seletivamente removidos das peles de tomate por extração passo a passo para produzir a cutícula de tomate livre de cera. A extração stepwise foi realizada com múltiplos solventes de diferentes polaridades sucessivas. Isso não só proporcionou a remoção abrangente da cera da pele do tomate, mas permitiu o isolamento de moieties individuais de cera com base em características de solubilidade também.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos de arquivo geológico. Agora você deve estar familiarizado com os princípios por trás da extração de Soxhlet, o procedimento para a extração de Soxhlet de uma amostra de sedimentos, e alguns exemplos de como a extração de Soxhlet pode ser usada para fins analíticos.

Obrigado por assistir!

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Procedure

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1. Instalação e Preparação de Materiais

  1. Colete uma amostra de sedimentos marinhos congelados, congelados, esmagados e homogeneizados. Uma amostra como esta contém muitos dos compostos necessários para os padrões.
    1. As normas são muitas vezes feitas a partir de sedimentos que são deixados após uma expedição ou análise de coring. Por exemplo, neste experimento, é extraído o sedimento obtido do 'Patch de Lama' localizado ao sul de Cape Cod. Este sedimento foi tomado como parte de uma expedição de coring, mas não será usado para responder a perguntas científicas. Podemos, portanto, usá-lo para fazer um padrão.
    2. Coloque um pedaço de ~100 g do sedimento no congelador durante a noite para que ele congele.
    3. Uma vez que o sedimento esteja completamente congelado, ligue o secador congelado (disponível em muitos varejistas de equipamentos científicos como Fisher) e espere até que o condensador atinja o ponto de ajuste (muitas vezes ~-30 °C).
    4. Coloque a amostra de sedimentos no secador congelado e feche o expurgo para começar a puxar um vácuo na amostra.
    5. Dependendo da quantidade de água no sedimento e do tamanho da amostra, pode levar vários dias para a amostra secar.
    6. Uma vez que a amostra esteja seca, desligue o secador congelado, desligue-o e remova a amostra.
    7. Coloque a amostra em uma argamassa enxaguada solvente e triture em pó usando um pilão. Faça isso com toda a amostra e guarde em um pote de vidro no congelador até ficar pronto para extrair.
  2. Dependendo do tamanho da amostra, utilize frascos com volumes que variam de 4 a 60 mL. Para este experimento, utilize frascos de vidro borossilicato (40 mL) e tampas seguras de solventes. Combustão dos frascos, pipetas de vidro borossilicato e latas de pesagem a 550 °C por 6h antes de garantir a remoção de possíveis contaminantes orgânicos.
  3. Obtenha diclorometano e metanol (ambos são comuns na maioria dos laboratórios de geoquímica orgânica), em seguida, use-os individualmente para enxaguar ferramentas de laboratório e vidros antes do uso. Uma mistura de diclorometano (DCM) ao metanol (MeOH; 9:1) é usada em muitos laboratórios para extrair biomarcadores eficientemente com uma ampla gama de polaridades. Os solventes devem estar livres de contaminantes orgânicos.
  4. Adquira um aparelho soxhlet para usar neste experimento (estes podem ser comprados da Fisher Scientific ou outro varejista científico), em seguida, lave-o e exploda-o a 550 °C por 6 h antes de usá-lo.
  5. Obtenha dedal de fibra de vidro (pode ser adquirido da Whatman) e combustão a 550 °C por 6 h antes de usá-lo.

2. Preparação da Amostra

  1. Coloque uma lata de pesagem queimada na escala do laboratório e depois na piche.
  2. Enxágüe a espátula de laboratório com solvente, em seguida, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra para a lata de pesagem, e regissão a massa.
    1. A massa da amostra varia dependendo do seu teor de matéria orgânica. Material magro de matéria relativamente orgânica (lama marinha) pode exigir vários gramas, enquanto material rico em matéria orgânica (tecido de folha) pode exigir muito menos.
  3. Transfira todo o material na lata de pesagem para um dedal de fibra de vidro queimado.

3. Extração

  1. Transfira ~400 mL da mistura DCM:MeOH (9:1) para o frasco de fundo redondo (o frasco deve estar mais da metade cheio) e coloque no manto de aquecimento. Adicione vários chips de ebulição (5-10) enxaguados com solventes.
  2. Coloque o dedal da amostra, de ponta aberta, na peça central do aparelho Soxhlet.
  3. Coloque a peça central em cima do frasco de fundo redondo e fixe com um grampo de vidro.
  4. Instale o condensador em cima da peça central do Soxhlet e fixe com um grampo de vidro.
  5. Conecte uma das linhas de água fria do condensador à linha de água fria no capô usando um grampo de mangueira. Encaminhe o outro para o ralo.
  6. Ligue a água para garantir a circulação adequada e a drenagem.
  7. Ligue o manto de aquecimento e ajuste a temperatura até que o solvente no frasco de fundo redondo esteja fervendo levemente.
  8. Monitore a extração algumas vezes durante a próxima hora.
    1. Verifique se a temperatura está bem definida em uma fervura baixa, o solvente está condensando no condensador e pingando na peça central, a peça central está enchendo e esvaziando corretamente, e a água está drenando corretamente para o ralo do capô.
  9. Monitore a extração nas próximas 36 horas.
    1. Certifique-se de que a temperatura esteja adequadamente colocada em um pouco de fervura, o solvente está condensando no condensador e pingando na peça central, a peça central está enchendo e esvaziando corretamente, a água está drenando corretamente para o ralo do capô, e o nível de solvente no frasco de fundo redondo ainda está cerca de meio cheio.
  10. Depois de 36 horas, pare a extração desligando o manto de aquecimento.
  11. Rotule o frasco de "TLE".

A extração de soxhlet é um método de isolar compostos, como lipídios, de uma grande quantidade de material sólido com um volume relativamente pequeno de solvente.

Muitos dos compostos relevantes para estudos paleoclimáticos não estão disponíveis para compra de empresas científicas de varejo. As normas desses compostos devem, portanto, ser preparadas a partir de amostras naturais.

Grandes quantidades de padrão são necessárias para avaliar o desempenho de um instrumento ao longo do tempo. Para obter uma quantidade adequada de um biomarcador para a preparação padrão, um grande volume de sedimentos deve ser extraído.

O extrator Soxhlet, inventado na década de 1870 por Franz von Soxhlet, permite a extração automatizada em lote a partir de um sólido, aumentando a eficiência geral enquanto usa uma pequena quantidade de solvente.

Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ele ilustrará a extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos marinhos para uso na paleotermometria e introduzirá algumas outras aplicações da extração de Soxhlet na ciência e química da Terra.

Um conjunto típico usa um frasco de fundo redondo, um condensador de água fria, e o próprio aparelho Soxhlet.   O sólido a ser extraído é colocado em um dedal na câmara central do aparelho. A extração é auxiliada pela adição de energia na forma de calor, conhecida como refluxo. O vapor solvente sobe através do caminho de destilação no aparelho Soxhlet para o condensador. Ao condensar, o solvente recolhe na câmara, dissolvendo parte do material orgânico no dedal. À medida que a câmara enche, o sifão também preenche. Quando o sifão está cheio, a solução flui de volta para o frasco. O nível da solução nunca excede a parte superior do dedal, então nenhum sólido entra no frasco.

O extrato lipíduo coleta continuamente no frasco, enquanto o solvente torna-se parte do próximo ciclo de extração. Assim, o ciclo pode se repetir indefinidamente sem perda de solvente.

A conservação do solvente, a natureza contínua da extração e a capacidade de acomodar grandes tamanhos de amostra torna a extração de Soxhlet ideal para isolar compostos orgânicos de grandes porções de material insolúvel.

Agora que você entende os princípios da extração de Soxhlet, vamos passar por um procedimento para a extração de Soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos.

Para este experimento, uma amostra de sedimentos marinhos em excesso de uma expedição de coring é usada. A amostra será congelada, esmagada e homogeneizada. Para obter mais instruções, consulte o vídeo desta coleção sobre Extração por Sonication.

Para se preparar para a extração, primeiro faça uma solução 9:1 de diclorometano para metanol. Esta solução será utilizada como solvente de extração e para lavar os vidros e instrumentos de laboratório.

Para remover contaminantes orgânicos, combustão o frasco de fundo redondo, aparelho Soxhlet, dedal de fibra de vidro e latas de pesagem por 6h a 550 °C. Lave um frasco de fundo redondo da solução DCM-metanol. Uma vez pronto para configurar a extração, enxágue uma espátula de laboratório e cinco a dez chips de ebulição com a solução de metanol DCM.

Para começar a construir o conjunto de extração, configure um manto de aquecimento em um capô de fumaça. Obtenha um condensador, uma suporte de suporte para garantir o frasco traseiro redondo, e o aparelho Soxhlet.

Tare uma lata de pesagem queimada. Com a espátula enxaguada com solvente, transfira aproximadamente 50 g de amostra para a lata de pesagem e registe a massa. Coloque o material no dedal de fibra de vidro queimado.

Em seguida, encha o frasco de fundo redondo e queimado um pouco mais da metade da solução de metanol DCM. Adicione os chips de ebulição lavados e coloque o frasco de fundo redondo no manto de aquecimento.

Em seguida, coloque o dedal da amostra aberto acabar na câmara do aparelho Soxhlet. Conecte o aparelho ao frasco de fundo redondo e aperte o aparelho no lugar.

Segure o condensador no topo do aparelho Soxhlet. Conecte a linha de água fria à porta inferior do condensador com um grampo de mangueira ou gravata zip. Conecte a linha de saída à porta superior do condensador e encaminhe-a para o ralo.

Ligue a água para o condensador e verifique o caminho de fluxo. Em seguida, ligue o manto de aquecimento e aqueça o solvente para o refluxo.

À medida que o solvente começa a condensar, certifique-se de que o condensado está pingando na câmara e que o extrato é siphoneed no frasco de fundo redondo. O solvente deve ficar em baixa fervura durante toda a extração.

Monitore o processo de extração e o fluxo de água do condensador até que a extração esteja completa. Em seguida, pare a extração desligando o manto de aquecimento. Uma vez que o extrato tenha esfriado, remova o aparelho condensador e soxhlet. Por fim, sele o frasco de fundo redondo contendo o extrato lipíduo total e armazene para posterior processamento.

A extração de soxhlet é frequentemente usada para análise química de uma amostra sólida, e também pode ser usada para preparação e purificação de reagentes.

A extração de soxhlet pode ser usada para detectar a presença de compostos de bifenil policlorados, ou PCBs, no ambiente. A eficiência de transferência de PCBs de peixes-presas para peixes predadores foi medida para obter mais informações sobre os riscos à saúde dos seres humanos e da vida selvagem por comer peixes contaminados. A extração de soxhlet de tecido de peixe permite a preparação de amostras para cromatografia gasosa e espectrometria de massa.

Compostos a serem introduzidos ao meio ambiente em grandes quantidades são analisados para a presença de PCBs. Biochar é um subproduto da pirólise da matéria orgânica que, quando adicionado ao solo, pode melhorar a qualidade do solo e captar poluentes. A validação dos métodos de produção de biochar para uso generalizado inclui a extração de Soxhlet para testar a presença de PCBs por cromatografia gasosa.

A extração de soxhlet também pode ser usada para purificar um sólido pela extração de compostos indesejados. Os ácidos graxos de cadeia longa foram seletivamente removidos das peles de tomate por extração passo a passo para produzir a cutícula de tomate livre de cera. A extração stepwise foi realizada com múltiplos solventes de diferentes polaridades sucessivas. Isso não só proporcionou a remoção abrangente da cera da pele do tomate, mas permitiu o isolamento de moieties individuais de cera com base em características de solubilidade também.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à extração soxhlet de biomarcadores lipídicos de sedimentos de arquivo geológico. Agora você deve estar familiarizado com os princípios por trás da extração de Soxhlet, o procedimento para a extração de Soxhlet de uma amostra de sedimentos, e alguns exemplos de como a extração de Soxhlet pode ser usada para fins analíticos.

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Results

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Ao final da extração, é produzido um extrato lipídeto total (TLE) para a amostra. O frasco de fundo redondo contém a matéria orgânica extraível da amostra de sedimentos. Esta TLE pode agora ser analisada, e seus componentes químicos identificados e quantificados.

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Applications and Summary

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O extrato da lama marinha contém compostos chamados alkenones, que são usados na paleoceanografia. Alkenones são alquilo-cetonas de cadeia longa produzidas por certas classes de algas haptofitos que vivem no oceano de superfície iluminada pelo sol3 (Figura 3). As duas alkenonas mais comuns têm 37 átomos de carbono e têm duas ou três ligações duplas neles. Os haptofititas ajustam a proporção dessas duas alkenonas em suas células de acordo com a temperatura da água em que vivem. A razão das duas alkenonas define a razão Uk'37:

Equação 1) Uk'37 = (C37:2) / (C37:2 + C37:3) 4,5

Cultura6,7 e estudos de calibração de sedimentos de topo de núcleo8 levaram ao desenvolvimento do Uk'37 Index como um proxy SST quantitativo. Neste trabalho nós usamos:

Equação 2) Uk'37 = 0,034 (SST) + 0,039; ±1,4 °C de 0 a 28 °C[7]

Alkenones são preservados em sedimentos que datam desde o Início do Eoceno (~56 milhões de anos atrás)9. Conhecer a distribuição de alkenonas em um núcleo de sedimentos através do tempo relaciona informações sobre a evolução da temperatura da superfície do mar naquele local. No entanto, é necessário primeiro certificar-se de que o instrumento mede com precisão e precisão a razão das duas alkenonas, e é por isso que as normas são necessárias.

Figure 3

Figura 3. Alkenones com 2 (C37:2) e 3 (C37:3) ligações duplas (esquerda) são produzidos por certas algas haptofitos que vivem no oceano de superfície iluminadas pelo sol (à direita). (Foto cortesia de Tim I. Eglinton, Instituição Oceanográfica de Woods Hole)

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References

  1. Jensen, W. B. The Origin of the Soxhlet Extractor J Chem Ed. 84, 1913-1914, (2007).
  2. Levey, M. Chemistry and Technology in Ancient Mesopotamia, Elsevier. 33-34, (1959).
  3. Conte, M. H., Thompson, A., Eglinton, G. Primary production of lipid biomarker compounds by Emiliania huxleyi: results from an experimental mesocosm study in fjords of southern Norway, Sarsia79, 319-332 (1994).
  4. Brassell, S. C., Eglinton, G., Marlowe, I. T., Pflaumann, U., Sarnthein, M. Molecular Stratigraphy - a New Tool for Climatic Assessment, Nature320 (6058), 129-133 (1986).
  5. Herbert, T. D. Alkenone paleotemperature determinations, in Treatise in Marine Geochemistry, edited by H. Elderfield, Elsevier 391-432 (2003).
  6. Prahl, F. G., Wakeham S. G., Calibration of Unsaturation Patterns in Long-Chain Ketone Compositions for Paleotemperature Assessment, Nature330(6146), 367-369 (1987).
  7. Prahl, F. G., Muehlhausen, L. A., Zahnle, D. L. Further evaluation of long-chain alkenones as indicators of paleoceanographic conditions, Geochimica et Cosmochimica Acta52(9), 2303-2310 (1988).
  8. Müller, P. J. et al. Calibration of the alkenone paleotemperature index U37K′ based on core-tops from the eastern South Atlantic and the global ocean (60°N-60°S), Geochimica et Cosmochimica Acta62(10), 1757-1772 (1998).
  9. Marlowe, I. T. et al. Long-chain Alkenones and Alkyl Alkenoates and the Fossil Coccolith Record of Marine-sediments, Chem Geol88(3-4), 349-375 (1990).

Transcript

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