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Environmental Microbiology

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Coltura ed enumerazione di batteri da campioni di terreno
 
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Coltura ed enumerazione di batteri da campioni di terreno

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autori dimostrativi: Bradley Schmitz e Luisa Ikner

I terreni superficiali sono una miscela eterogenea di particelle inorganiche e organiche che si combinano insieme per formare aggregati secondari. All'interno e tra gli aggregati ci sono vuoti o pori che contengono visivamente sia aria che acqua. Queste condizioni creano un ecosistema ideale per i batteri, quindi tutti i terreni contengono vaste popolazioni di batteri, di solito oltre 1 milione per grammo di suolo.

I batteri sono il più semplice dei microrganismi, noti come procarioti. All'interno di questo gruppo procariotico, ci sono i microbi filamentosi noti come actinomiceti. Gli actinomiceti sono in realtà batteri, ma sono spesso considerati un gruppo unico all'interno della classificazione dei batteri a causa della loro struttura filamentosa, che consiste in più cellule infilate insieme per formare ife. Questo esperimento utilizza i mezzi del glicerolo che selezionano le colonie di actinomiceti, durante la diluizione e la placcatura. Tipicamente, gli actinomiceti sono circa il 10% della popolazione batterica totale. Batteri e actinomiceti si trovano in ogni ambiente sulla Terra, ma l'abbondanza e la diversità di questi microbi nel suolo non ha eguali. Questi microbi sono anche essenziali per la vita umana e influenzano ciò che le persone mangiano, bevono, respirano o toccano. Inoltre, ci sono specie batteriche che possono infettare le persone e causare malattie, e ci sono batteri che possono produrre prodotti naturali in grado di guarire le persone. Gli actinomiceti sono particolarmente importanti per la produzione di antibiotici, come la streptomicina. I batteri sono fondamentali per il ciclo dei nutrienti, la crescita delle piante e la degradazione dei contaminanti organici.

I batteri sono molto diversi in termini di numero di specie che si possono trovare nel suolo, in parte perché sono fisiologicamente e metabolicamente diversi. I batteri possono essere eterotrofici, il che significa che utilizzano composti organici, come il glucosio, per il cibo e l'energia, o autotrofici, il che significa che utilizzano composti inorganici, come lo zolfo elementare, per il cibo e l'energia. Possono anche essere aerobici, utilizzando ossigeno per la respirazione, o anaerobici, utilizzando forme combinate di ossigeno, come nitrato o solfato, per respirare. Alcuni batteri possono utilizzare ossigeno o forme combinate di ossigeno e sono noti come anaerobi facoltativi.

Principles

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Un modo per enumerare il numero di batteri presenti in un campione di terreno è utilizzare la metodologia di diluizione e placcatura. Questa metodologia utilizza l'agar come mezzo per la crescita batterica, un processo definito "tecnologia coltivabile". A causa del gran numero di batteri presenti all'interno dei terreni, un piccolo campione di terreno viene diluito in serie in acqua, prima di essere placcato su agar all'interno di una piastra di Petri. Tipicamente, una piccola quantità di terreno contenuta entro 0,1 a 1 mL della sospensione del suolo diluito viene "distribuita" sulla superficie della piastra di agar. Le piastre contengono agar, che è fuso quando è caldo, ma solido quando è freddo. Oltre all'agar, i nutrienti, come il lievito peptone o un prodotto disponibile in commercio come R2A, vengono aggiunti al mezzo per consentire la crescita di batteri eterotrofi.

La diluizione e la placcatura sono una tecnologia economica e relativamente semplice per l'enumerazione dei batteri del suolo. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti alla tecnica. Alcuni errori e ipotesi comuni associati ai saggi di diluizione e placcatura sono i seguenti: si presume che ogni singolo batterio del suolo dia origine a una colonia, ma in realtà una colonia può derivare da un grumo di cellule, con conseguente sottovalutazione del vero conteggio coltivabile. Durante la diluizione seriale del terreno, le particelle di terreno possono depositarsi (cadere sul fondo), quindi la vera aliquota del suolo non viene trasmessa nella diluizione successiva. Molti microbi del suolo sono vitali ma non coltivabili. I batteri a crescita lenta potrebbero non provocare colonie visibili entro un lasso di tempo ragionevole (1-2 settimane).

Inoltre, i batteri anaerobici non crescono in condizioni aerobiche e i batteri che crescono sono selezionati dai nutrienti aggiunti al mezzo. Così R2A seleziona per i batteri eterotrofi, mentre lo zolfo elementare seleziona per gli ossidanti autotrofici dello zolfo. Nel complesso, si stima che solo lo 0,1-1% di tutti i batteri del suolo possa essere coltivato. Pertanto, la diluizione e la placcatura dei batteri del suolo rappresentano solo i batteri coltivabili e sottovalutano la vera popolazione vitale del suolo di uno o due ordini di grandezza. Un esempio di colonie batteriche eterotrofiche risultanti dalla diluizione e dalla placcatura del suolo è mostrato nella Figura 1. Si noti che circa 1 milione di cellule batteriche sono necessarie affinché una colonia sia visibile ad occhio nudo.

Questo esperimento dimostra la metodologia di diluizione e diffusione della placcatura utilizzata per enumerare il numero di batteri all'interno di un campione di terreno. In particolare, vengono utilizzati due mezzi: uno progettato per tutti i batteri e l'altro che seleziona per gli actinomiceti. Una volta che le colonie batteriche sono cresciute sulle piastre di agar, isolare le colture pure di colonie selezionate utilizzando una tecnica a piastra striata. Tali culture pure possono quindi essere ulteriormente analizzate e caratterizzate per tratti e funzioni specifici.

Figure 1
Figura 1. Colonie eterotrofiche su una piastra di agar R2A. Un certo numero di colonie discrete con morfologia diversa sorgono dopo la diluizione e la placcatura dal suolo. Autorizzazione all'uso concessa da Academic Press.

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Procedure

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1. Preparazione delle diluizioni del suolo

  1. Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere a 95 ml di acqua deionizzata. Agitare bene la sospensione ed etichettare come "A".
  2. Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL della sospensione con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco d'acqua deionizzata da 9 mL. Vortice completo, ed etichetta come "B".
  3. Ripetere questa fase di diluizione tre volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e uno spazio vuoto d'acqua deionizzato da 9 mL. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10-1 a 10-5 grammi di terreno per mL

2. Realizzazione di piastre diffuse per la coltura batterica

  1. Per far crescere le colonie batteriche, prendere tre piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Campioni di vortice C, D ed E e pipetta 0,1 ml su ciascun piatto. Questo aumenta ulteriormente il valore di diluizione, di un fattore dieci (C = 10-3, D = 10-4, E = 10-5).
  2. Quindi, immergere uno spandi bicchiere nell'etanolo. Mettere lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l'etanolo. Questo sterilizzerà lo spargitore.
  3. Tenere lo spargitore sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente la piastra, tenendo il coperchio vicino. Toccare lo spargitore all'agar lontano dall'inoculo (Inoculum = cellule utilizzate per iniziare una coltura) per raffreddare, quindi diffondere la goccia di inoculo intorno alla superficie dell'agar fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Sostituire il coperchio della piastra.
  4. Riafirgire lo spargitore e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare l'agar con organismi presenti nell'aria
  5. Incubare le piastre batteriche a temperatura ambiente per 1 settimana. Assicurarsi che le piastre siano invertite durante l'incubazione per evitare che gocce di umidità dovute alla condensa cadano sulla superficie dell'agar.

3. Fare piastre di diffusione per Actinomiceti

  1. Per coltivare actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Usando le tecniche mostrate in precedenza, distribuire la piastra 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni inferiori sono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 ° della popolazione batterica (B = 10-2, C = 10-3, D = 10-4).
  2. Incubare le piastre di actinomicete (invertite) a temperatura ambiente per 2 settimane.

4. Conteggi batterici e actinomiceti

  1. Dopo l'incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati su agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall'incolore all'arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente alle colonie di essere distinte dal tocco con un anello sterile.
  2. Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Conta solo le piastre con 30-200 colonie per piatto.

5. Isolamento delle culture pure

  1. Selezionare le singole colonie batteriche da una qualsiasi delle piastre. Più colonie possono essere selezionate se c'è particolare interesse per il suolo. Utilizzare una piastra ad alta diluizione, in quanto tende ad avere colonie pure che sono ben separate. Scegli solo colonie che sono ben separate dalle colonie vicine e sembrano morfologicamente distinte l'una dall'altra.
  2. Sterilizzare il cappio immergendolo nell'alcool e infiammandolo. Apri rapidamente la capsula di Petri di interesse e tocca il cappio in un punto nudo nell'agar per raffreddarlo. Quindi, rimuovi una piccola quantità di una colonia di interesse sul loop.
  3. Prendendo un piatto di lievito peptone fresco, fai una striscia lunga pochi centimetri su un lato. Sterilizzare e raffreddare di nuovo, quindi fare una striscia che attraversa la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa "diluizione" striata fa in modo che le cellule sul loop vengano separate l'una dall'altra. Posizionare la piastra in una zona buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.

Determinare un conteggio accurato dei batteri ambientali è fondamentale per valutare la salute di un ecosistema del suolo. Questo può essere ottenuto coltivando colonie batteriche con diluizioni appropriate.

I batteri del suolo sono una parte importante di un ecosistema del suolo sano, giocando ruoli nella decomposizione, nella fissazione dell'azoto e nel ciclo dei nutrienti. I terreni superficiali sono un substrato di particelle organiche e inorganiche che formano una matrice complessa che circonda i pori che si riempiono di aria o acqua. Queste condizioni creano un ecosistema ideale per i batteri, con terreni superficiali che contengono tipicamente fino a un milione di batteri per grammo.

A causa di questa alta concentrazione di batteri, la diluizione è necessaria prima di placcare sui mezzi di crescita. Le diluizioni seriali possono ridurre la concentrazione del campione di terreno originale a livelli abbastanza bassi da consentire la crescita di singole colonie su piastre di media, consentendo il calcolo dei conteggi iniziali di batteri nel campione di terreno.

Questo video illustrerà come preparare le diluizioni seriali dei campioni di terreno, come placcare questi campioni batterici e come calcolare i conteggi batterici del suolo dalle piastre di diluizione.

I batteri sono semplici organismi procariotici, ma molto diversi in termini di specie ed ecosistema. Gli actinomiceti sono un sottoinsieme di batteri che sono spesso considerati un gruppo unico a causa della loro struttura filamentosa, dove crescono infilati insieme per formare ife.

Tipicamente, gli actinomiceti rappresentano il 10% della popolazione batterica totale nel suolo. Batteri e actinomiceti sono abbondanti in quasi tutti gli ambienti della Terra, ma si trovano in una diversità e abbondanza senza pari nel suolo.

I batteri del suolo sono enumerati e potenzialmente coltivati e identificati mediante placcatura di diluizione. Qui, un campione di terreno viene diluito in serie in acqua e quindi disperso su piastre di crescita di agar. Le colonie risultanti vengono quindi contate. Questo valore, insieme al fattore di diluizione, viene utilizzato per chiarire la concentrazione iniziale di batteri nel suolo.

La placcatura di diluizione è un metodo comune, economico e semplice per l'enumerazione batterica, ma soffre di diversi inconvenienti. Il terreno non dovrebbe essere lasciato depositare durante le diluizioni, che potrebbero portare a una crescita distorta. Alcuni batteri del suolo non si coltivano sui piatti o crescono troppo lentamente per essere osservati. Inoltre, questo metodo presuppone che le colonie siano formate da un singolo batterio, ma possono derivare da grumi di più cellule.

Alcune specie batteriche crescono meglio su diversi mezzi di crescita. Un substrato comune per la coltura di una vasta gamma di batteri è una piastra di lievito agar-peptone. Gli actinomiceti crescono preferenzialmente su piastre a base di glicerolo-caseina, che meglio si adattano alla crescita di questi batteri filamentosi.

Ora che hai capito il concetto alla base dell'enumerazione batterica, vediamo come questo processo viene eseguito in laboratorio.

Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere a 95 ml di acqua deionizzata. Agitare bene la sospensione ed etichettare come "A". Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL della sospensione con una pipetta sterile e trasferirla in 9 mL di acqua deionizzata. Vortice completo, ed etichetta come "B".

Ripetere questa fase di diluizione 3 volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e 9 mL di acqua deionizzata. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10-1 a 10-5 grammi di terreno per ml.

Per far crescere le colonie batteriche, prendere 3 piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Vortex i campioni corrispondenti e pipetta 0,1 mL su ciascun piatto. Poiché le CFU sono riportate per ml, l'utilizzo di 0,1 mL aumenta ulteriormente la diluizione di un fattore dieci.

Quindi, immergere uno spandi bicchiere nell'etanolo. Mettere lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l'etanolo. Questo sterilizzerà lo spargitore.

Tenere lo spargitore sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente la piastra, tenendo il coperchio vicino. Toccare lo spargitore all'agar lontano dall'inoculo per raffreddare, quindi distribuire la goccia di inoculo sulla superficie fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Sostituire il coperchio della piastra.

Riafirgire lo spargitore e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare la piastra con organismi presenti nell'aria. Invertire le piastre per evitare che le gocce di umidità cadano sull'agar e incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.

Per coltivare actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Usando le tecniche mostrate in precedenza, distribuire la piastra 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni più basse sono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 della popolazione batterica.

Infine, invertire queste piastre e conservare a temperatura ambiente per due settimane.

Dopo l'incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati su agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall'incolore all'arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente alle colonie di essere distinte dal tocco con un anello sterile.

Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Conta solo le piastre con 30-200 colonie per piatto.

Per coltivare colture di singoli batteri specifici, selezionare colonie discrete da una qualsiasi delle piastre, scegliendo colonie ben separate dalle colonie vicine. Sterilizzare un anello di diffusione, quindi aprire la piastra e toccare il ciclo in un punto vuoto per raffreddare. Quindi, scegli una piccola quantità della colonia di interesse sul loop.

Prendendo un piatto di lievito peptone fresco, fai una striscia lunga pochi centimetri su un lato. Sterilizzare e raffreddare di nuovo, quindi fare una striscia che attraversa la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa "diluizione" striata fa in modo che le cellule sul loop vengano separate l'una dall'altra. Posizionare la piastra in una zona buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.

Dai conteggi delle colonie batteriche e actinomicete, è possibile determinare le unità formanti colonie per grammo di terreno. Il numero di colonie per grammo di terreno è pari al numero di colonie contate sulla piastra, moltiplicato per il reciproco della diluizione placcata. Ad esempio, se 46 colonie vengono contate su una piastra di diluizione di 10-5 con un inoculante da 0,1 ml, il CFU per grammo di terreno è pari a 10-6 per 46, o 46 milioni di CFU per grammo di terreno.

L'esecuzione di conteggi e colture batteriche è un primo passo fondamentale in molte indagini o protocolli scientifici.

Il terreno sano contiene tra 106 e 108 batteri per grammo. L'enumerazione batterica del suolo può essere utilizzata per determinare la salute dei terreni di interesse e conteggi inferiori a 106 e 108 batteri per grammo indicano un terreno malsano o povero. Ciò può essere causato da una mancanza di nutrienti o materia organica, stress abiotico dovuto a pH estremo del suolo o contaminazione del suolo.

Molti tipi di antibiotici usati in medicina oggi sono stati identificati per la prima volta da batteri o funghi che vivono nel suolo. Isolare ceppi puri dalle colture del suolo può aiutare potenzialmente gli scienziati a identificare nuovi composti antibiotici. Qui, batteri di prova o composti isolati di interesse possono essere aggiunti a piatti coltivati con prati batterici e i loro effetti sulla crescita del prato registrati. Macchie chiare nei prati batterici in cui la crescita è stata inibita dai batteri o dal composto di prova possono indicare attività antibiotica.

Le leguminose tra cui piselli e fagioli si basano su relazioni simbiotiche con batteri che fissano l'azoto. Questi batteri vivono liberamente nel terreno o all'interno dei noduli nel sistema radicale e producono composti azotati che vengono utilizzati dalla pianta. Nei terreni poveri, l'integrazione di leguminose con batteri azoto-fissanti coltivati dai terreni può aumentare la crescita e la salute delle piante. Ciò può portare a piante più grandi e più resistenti, che a loro volta danno una maggiore resa delle colture.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'enumerazione batterica. Ora dovresti capire come eseguire le diluizioni dei campioni di terreno, come placcare per il conteggio delle colonie e l'isolamento delle colonie e come calcolare il numero di batteri nei campioni di suolo. Grazie per l'attenzione!

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Results

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Un campione di terreno di 10 g con un contenuto di umidità del 20% su base di peso secco viene analizzato per batteri coltivabili vitali tramite tecniche di diluizione e placcatura. Le diluizioni sono state effettuate come indicato nella Tabella 1. 1 mL di soluzione E viene versato su un mezzo appropriato e si traduce in 200 colonie batteriche.

Equation 1

Ma, per 10 g di terreno umido,

Equation 2

Pertanto

Equation 3

Passo Diluizione
10 g di terreno (peso/volume) 95 mL di soluzione salina (soluzione A) 10-1
1 mL di soluzione A (volume/volume) 9 mL di soluzione salina (soluzione B) 10-2
1 mL di soluzione B (volume/volume) 9 mL di soluzione salina (soluzione C) 10-3
1 mL di soluzione C (volume/volume) 9 mL di soluzione salina (soluzione D) 10-4
1 mL di soluzione D (volume/volume) 9 mL di soluzione salina (soluzione E) 10-5

Tabella 1: Diluizione e placcatura dei campioni.

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Applications and Summary

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Ci sono due applicazioni fondamentali di diluizione e placcatura dei batteri del suolo. La prima applicazione è l'enumerazione dei batteri coltivabili all'interno di un particolare terreno. La quantificazione del numero di batteri del suolo fornisce un'indicazione della salute del suolo. Ad esempio, se ci sono da 106 a 108 batteri coltivabili presenti per grammo di terreno, questo sarebbe considerato un numero sano. Un numero inferiore a 106 per grammo indica una salute del suolo più povera, che può essere dovuta alla mancanza di sostanze nutritive come si trova nei terreni a bassa materia organica; stress abiotico imposto da valori estremi di pH del suolo (pH < 5 o > 8); o tossicità imposta da contaminanti antropogenici organici o inorganici.

La seconda applicazione principale è la visualizzazione e l'isolamento di colture pure di batteri. Le colture pure possono successivamente essere caratterizzate e valutate per caratteristiche specifiche che possono essere utili in applicazioni mediche o ambientali. Gli esempi includono: produzione di antibiotici; biodegradazione di sostanze organiche tossiche; o rizobia specifica utile per la fissazione dell'azoto da parte di leguminose, come piselli o fagioli.

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