Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner
Las bacterias se encuentran entre las más abundantes formas de vida en la tierra. Se encuentran en cada ecosistema y son vitales para la vida diaria. Por ejemplo, afectan las bacterias lo que come, beber y respirar, y hay células bacterianas más dentro de un cuerpo de células de mamíferos. Debido a la importancia de las bacterias, es preferible estudiar una especie particular de bacterias en el laboratorio. Para ello, las bacterias se cultivan bajo condiciones controladas en cultivo puro, lo que significa que sólo un tipo de bacteria está bajo consideración. Las bacterias crecen rápidamente en cultivo puro, y número de células aumenta dramáticamente en un corto periodo de tiempo. Midiendo la tasa de población de la célula aumentan con el tiempo, una "curva de crecimiento" a desarrollarse. Esto es importante cuando se pretende utilizar o inocular a un número conocido de la cepa bacteriana, por ejemplo, para mejorar el crecimiento de las plantas, incrementar la biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos o producir antibióticos u otros productos naturales a una escala industrial.
Principles
Reproducción bacteriana se produce por fisión binaria, en la que una célula bacteriana se divide y se convierte en dos células (figura 1). El tiempo necesario para la división celular se conoce como la generación de medio tiempo o tiempo de duplicación, que es el tiempo necesario para el número de células a doble.
Figura 1. Exponencial la división celular. Cada división celular produce una duplicación del número de células. En un número bajo de células, el aumento no es muy grande; sin embargo después de algunas generaciones, celular números aumento explosivo. Después de números divisiones, hay 2n células.
Para entender y definir el crecimiento de microorganismos particulares, se colocan en un matraz, donde se controlan el suministro de nutrientes y condiciones ambientales. Si el medio líquido proporciona todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y parámetros ambientales propicios para el crecimiento, el aumento de números puede medirse como una función del tiempo para obtener una curva de crecimiento. Se observan varias fases de crecimiento distintas dentro de una curva de crecimiento (figura 2). Se trata de la fase lag, la exponencial o fase logarítmica, fase estacionaria y la fase de muerte, cada uno de los cuales se asocian con cambios fisiológicos específicos (tabla 1).
| Fase | Características | ||
| Fase lag | Crecimiento lento o falta de crecimiento debido a la adaptación fisiológica de las células a condiciones de cultivo o dilución de exoenzimas debido a la densidad celular inicial de baja. | ||
| Exponencial o fase | Tasas de crecimiento óptimo, durante que números de celular doble en intervalos de tiempo discretos conocidos como el tiempo de generación malo. | ||
| Fase estacionaria | Crecimiento (división celular) y la muerte de las células de contrapeso entre sí dando por resultado ningún aumento neto en número de células. La tasa de crecimiento reducida es generalmente debido a una falta de nutrientes o acumulación de constituyentes de residuos tóxicos. | ||
| Fase de muerte | Tasa de mortalidad supera la tasa de crecimiento lo que resulta en una pérdida neta de células viables. | ||
Tabla 1. Las cuatro fases del crecimiento bacteriano.
Figura 2. Una curva de crecimiento típica de una población bacteriana. Comparar la forma de las curvas basado en formadoras de colonias (UFC) de unidades versus densidad óptica, particularmente en la fase de muerte. La diferencia es debido a que las células muertas todavía resultado de turbiedad, pero no forman colonias viables en la cultura.
En general, es a menudo crítico para determinar la cinética de crecimiento bacteriano de un aislado bacteriano determinado, con el fin de conocer el número de células bacterianas presentes en el medio líquido. Hay diferentes maneras de medir el crecimiento en un medio líquido, incluyendo mediciones de turbidez con un espectrofotómetro colorimétrico y galjanoplastia de dilución seriada. Mediciones de turbidez se basan en el hecho de que las células más presentan en el medio líquido, el más turbio que el líquido se convierte. Placas de dilución seriada implica ensayo el número de células en el medio líquido que puede formar colonias viables de sólida cultura, una medida conocida como "unidades formadoras de colonias" de la cultura. Observe, sin embargo, que tales ensayos de placas pueden utilizarse para las bacterias que son, de hecho, cultivable.
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Procedure
1. colección de alícuotas de cultivo bacteriano
- Un día antes de la colección de puntos de tiempo de crecimiento, sembrar 20 mL de medio de caldo (TSB) de soya tripticasa en un matraz de 50 mL con e. coli.
- Incubar durante una noche a 27 º C. Este período de incubación relativamente largo resulta en una población de fase estacionaria del tipo salvaje de e. coli de aproximadamente 109 UFC/mL.
- Al día siguiente, utilice 100 μl de la cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (en un matraz de 500 mL). Mezclar bien. Sacar una alícuota de 5 mL y refrigere inmediatamente a 4 ° C. Esto es T = 0 o punto del tiempo T0 y debe contener aproximadamente 4 x 105 UFC/mL.
- Colocar el matraz de la restante e. coli (245 mL) en un 37 º C agitando la incubadora. Retirar alícuotas de 5 mL de cultura cada hora, hasta 8 h. almacenar cada alícuota a 4 ° C. Designar estas alícuotas T1 a T8.
2. serie dilución
- Extraer alícuotas de e. coli el refrigerador y el lugar en el hielo para el transporte. No todas las culturas en hielo hasta su uso.
- Establecer una serie de tubos de dilución para obtener varias diluciones de cada cultura de e. coli (figura 3). Los tubos del microfuge son convenientes para esta función. Cada tubo de dilución debe tener 900 μl de líquido de dilución (solución salina estéril). Se necesita una serie de diluciones para cada cultivo de e. coli (T0 al T8); etiquetar cada tubo según la tabla 2.
Figura 3. Diagrama esquemático mostrando el procedimiento para la e. colide la galjanoplastia. - Comienzan las diluciones añadiendo 100 μl de e. coli del tubo con la etiqueta T0 (la inicial cultura de e. coli ) al tubo A, que es la dilución 10-1 T0. Vórtice el tubo durante 5 s.
- Posteriormente, añada 100 μl del tubo al siguiente tubo de solución salina, tubo B, que es la dilución 10-2 T0. Seguir con la serie de la dilución necesaria para cada alícuota de punto de tiempo. Recuerde vortex cada antes del tubo de transferencia. También es importante utilizar una punta de pipeta nueva para cada transferencia.
| Cultura de e. coli | Las diluciones necesitan y tubo # | ||||||
| A | B | C | D | E | F | G | |
| T0 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T1 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T2 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||||
| T3 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | |||
| T4 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | ||
| T5 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T6 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T7 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T8 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
Tabla 2. Serie de diluciones requerida para cada cultivo de e. coli .
3. galjanoplastia
- Tres diluciones de cada alícuota de punto de tiempo de cultura de e. coli serán plateadas, según tabla 3. Etiqueta de las placas con el punto del tiempo (T1 a T8), el factor de dilución y el volumen a añadir. Usar las placas por triplicado para cada dilución.
- Añadir 100 μl de cada dilución en la placa transfiriendo la cantidad al centro de la placa de agar (figura 3). Inmediatamente extendió la alícuota utilizando una llama esterilizado "L" en forma de varilla de vidrio. Si la alícuota no se difunde inmediatamente, sorbs en situ en la placa, dando lugar a crecimiento excesivo bacteriano en el lugar de la inoculación inicial.
- Repita la chapa para cada serie de dilución tiempo puntos T1 a T8. No olvide esterilizar la varilla entre las placas y sobre todo entre diferentes diluciones.
- Una vez que las placas se han secado durante unos minutos, invertir y colocar en incubadora de 37 ° C durante la noche. Invertir las placas impedir la condensación caigan sobre la placa de agar. Después de incubación durante la noche, las placas deben guardarse en el refrigerador.
| E. coli cultura | Diluciones a platear | ||
| T0 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T1 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T2 | 10-2 | 10-3 | 10-4 |
| T3 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
| T4 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| T5 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T6 | 10-6 | 10-7 | 10-8 |
| T7 * | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T8 * | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
* Diluciones más bajas tienen en cuenta poblaciones inferiores debido a la fase de muerte.
Tabla 3. Protocolo para cultivos de e. coli de la galjanoplastia.
4. recuento de colonias y calcular el tiempo de generación malo
- Examinar las placas para la uniformidad de las colonias y la falta de contaminación.
- Para cada punto del tiempo (T0 al T8), escoge una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias y cuenta por triplicado.
- El factor de dilución, back-calcular el número de células por mL del cultivo original en tiempo puntos T0 al T8. Por ejemplo, si el número de colonias resultantes de la dilución 10-4 es de 30, 28 y 32:
Significa el número de colonias = 30 colonias
Estos surgieron de 0,1 mL de una dilución de 10-4
Número de colonias por mL = 30 x 104 = 3 x 106 - Diagrama log10 UFC/mL frente al tiempo (en horas).
- De la gráfica, determinar la fase exponencial de crecimiento. 2 puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial y los correspondientes números de celular en cada momento, calcular el tiempo de generación malo.
Medir la tasa de crecimiento de las bacterias es una técnica microbiológica fundamental, y tiene amplio uso en investigación básica, así como en aplicaciones agrícolas e industriales.
Las bacterias están entre las más abundantes formas de vida en la tierra, estando presente en cada ecosistema, incluyendo el cuerpo humano. Ciertas especies bacterianas también son genéticamente muy manejables y han sido utilizados como modelos de investigación o para producir productos naturales o sintéticos a escala industrial. Sin embargo, no todas las especies bacterianas pueden ser cultivadas en el laboratorio. Para aquellos que pueden, una característica importante es la tasa de multiplicación, o "cinética de crecimiento".
Medir la tasa de crecimiento de un cultivo bacteriano puede informar a los científicos sobre sus fisiológicos y metabólicos funciona y también es útil para obtener un número exacto de la célula de las bacterias para aplicaciones posteriores.
Este video introducir los principios del análisis de la velocidad de crecimiento bacteriano, demostrar un protocolo para la caracterización de la tasa de crecimiento con una "curva de crecimiento" y por último, explorar varias aplicaciones de la ciencia ambiental para medir la cinética de crecimiento bacteriano.
Las bacterias generalmente reproducen asexualmente, multiplicándose por simple fisión binaria donde una célula parental se divide en dos células hijas idénticas. Bajo condiciones de crecimiento favorables donde nutrientes están disponibles en abundancia y parámetros ambientales como temperatura, son todo propicio para el crecimiento, la tasa de multiplicación excede la tasa de mortalidad. Esto resulta en un crecimiento exponencial.
Midiendo la cantidad de las bacterias en un cultivo en función del tiempo, puede obtenerse una curva de crecimiento. Cultivo de bacterias en un cultivo líquido en condiciones óptimas produce una curva de crecimiento con una forma característica que se puede dividir en varias fases. La curva comienza con una "fase de retraso", cuando el crecimiento es lento mientras que las bacterias se aclimataron a las condiciones de cultivo. El siguiente es el "registro" o "fase exponencial", cuando la bacteria experimenta un crecimiento exponencial. Crecimiento se detiene eventualmente agotarse nutrientes y productos de desecho se acumulan, resultando en una "fase estacionaria". Por último, una vez que la tasa de multiplicación es superada por la tasa de muerte celular, la cultura entra en la fase de"muerte".
Para construir una curva de crecimiento, se cuentan números bacterianos en un matraz de cultivo líquido en diferentes puntos temporales durante un periodo de cultivo. Conteos bacterianos pueden obtenerse por varios métodos diferentes. Un enfoque común es para medir la densidad óptica - o "OD" - 600, que es la absorbancia de la solución bacteriana de la luz en una longitud de onda de 600 nm.
Otro método es determinar la "UFC", o unidades formadoras de colonias, por mililitro de la cultura. Debido a la naturaleza clonal del crecimiento bacteriano, una bacteria en una cultura puede expandir teóricamente en una colonia observable en una placa de agar. Por una serie de diluciones de un cultivo bacteriano de la galjanoplastia alcanzar una concentración bacteriana donde las colonias individuales, discretas pueden ser observado, un método llamado "placas de la dilución serial", el recuento de colonias se puede utilizar para la espalda-calcular la concentración bacteriana en términos de UFC / mL.
Ahora que usted comprende cómo crecimiento bacteriano puede ser analizado, vamos a ir a través de un protocolo para la realización de análisis de la curva de crecimiento en cultivos puros de un modelo bien establecido bacteriano, Escherichia coli, usando la dilución serial método.
Un día antes de la hora punto de colección, sembrar 20 mL de caldo de soja trypticase preesterilizadas o TSB, medio en un matraz de 50mL con una sola Colonia de e. coli.
Incubar el cultivo durante la noche a 37 ° C con agitación. Para e. coli, esto resultaría en una población de fase estacionaria de aproximadamente 109 UFC/mL.
Al día siguiente, inocular 100 μL de la cultura durante la noche en 250 mL de TSB en un matraz de 500 mL. Mezclar bien. Esto produce una cultura diluida de aproximadamente 4 x 105 UFC/mL. Almacenar 5 mL de esta cultura diluida en un tubo de cultivo. Esta es la parte alícuota de un punto de tiempo 0 y T0. Inmediatamente refrigerar a 4 ° C.
Incubar el volumen restante de la cultura a 37 ° C con agitación. Cada hora después de 8 h, recogen alícuotas de 5 mL de la cultura. Designar estas muestras T1 a T8y guarde todos ellos a 4 ° C hasta su uso.
En el día del experimento, sacar las alícuotas de punto de tiempo de e. coli de la nevera y mantener en hielo. Utilice los tubos del microfuge estériles, cada una con 900 μL de solución salina estéril, para configurar una serie de diluciones de cada alícuota según la siguiente tabla.
Mezcla la cultura de0 T bien por suavemente Vortex, añada 100 μL al tubo de la serie de diluciones, realizar un 1 en 10, o 10-1 dilución. Tubo vórtice a la mezcla y utilizando una nueva pipeta, añada 100 μL del tubo al tubo B, haciendo el 1 en 100, o 10-2 dilución.
Repita el proceso para cada alícuota de cultivo y hacen que la serie de la dilución según la tabla 2. Una vez que se han hecho la serie de diluciones para todas las muestras de punto de tiempo, tienen el número adecuado de placas de agar de soja trypticase estéril preparado para placas bacterianas.
3 diluciones de cada cultura de punto de tiempo se plateó por triplicado según la siguiente tabla. Etiqueta de las placas en consecuencia. Entonces, Pipetee 100 μL de cada cultivo adecuadamente diluida en el centro de la placa de agar respectivos. Llama-esterilizar una varilla de vidrio en forma de "L", fresco al tocar la barra para el agar de inóculo y difundir inmediatamente el líquido sobre la superficie del agar. Tenga en cuenta que una demora en la divulgación podría resultar en el sobrecrecimiento bacteriano en el lugar de la inoculación.
Continuar plateando cada serie de dilución para los 9 punto de culturas, el vidrio separarse barra entre cada serie de dilución se llama esteriliza el tiempo.
Una vez que las placas se deja secar durante unos minutos, invertir y colocarlos en la incubadora de 37 ° C durante la noche. Después de este período de crecimiento, las placas pueden almacenarse a 4 ° C.
Después de la incubación de las placas de la dilución, examínelos para contaminación y uniformidad de las colonias. Cada vez el punto cultura, elegir la dilución que se encuentran entre 30-300 colonias por placa. Contar el número de colonias en cada una de las placas por triplicado para esa dilución.
El número medio de colonias para cada dilución y el factor de dilución, calcular la concentración de bacterias en la cultura original en cada punto de tiempo en UFC/mL. Por ejemplo, si hay en promedio 30 colonias de la triplicado placa conjunto obtenida de 0,1 mL de la 10-4, o 1 en 10.000, dilución, entonces allí sería 30 dividido por 0,1 mL multiplicado por 10.000, o 3 millones UFC/mL.
Utilizando la concentración bacteriana calculado para cada punto del tiempo, una gráfica del log base 10 de las concentraciones de bacterias, en UFC/mL, contra el tiempo en horas. En el gráfico, identificar la fase logarítmica de crecimiento de la cultura bacteriana original y escoger dos de los puntos del tiempo dentro de la fase de registro, que el primero de estos puntos de tiempo t = 0. Calcular el tiempo de generación malo usando la ecuación de X es igual a 2 a la potencia de n multiplicado por X0 donde X es la concentración bacteriana en el tiempo t, X0 es la concentración inicial en t = 0, y n es el número de generaciones que ha transcurrido entre los dos puntos de tiempo.
Por ejemplo, supongamos que X0 es de 1.000 ufc/mL y en t = 6 h, que la concentración es de 16.000 ufc/mL. Utilizando la ecuación, obtenemos que 4 generaciones han ocurrido dentro de las 6 h, que da un tiempo de generación de 6 dividido por 4 o 1.5 h por generación.
Medición de la cinética de crecimiento bacteriano es fundamental para muchas aplicaciones para fines de bioingeniería, la agricultura o la investigación.
Un uso para conocer la tasa de crecimiento bacteriano es permitir una cantidad precisa de un cultivo bacteriano obtenido para sembrar otro cultivo o medio. Por ejemplo, ciertos cultivos, como leguminosas, necesitan cultivarse con bacterias simbióticas conocidas como rizobios que colonizan las raíces de las plantas a los nódulos de la forma y "fijan" el nitrógeno - conversión de nitrógeno atmosférico en amoniaco, que puede ser utilizado por la planta. Para aplicaciones agrícolas, se agrega una cantidad conocida de rizobios a un medio a base de turba de carbón, que se utiliza para inocular semillas de leguminosas para establecer la simbiosis planta-bacteriana.
Análisis de crecimiento también pueden utilizarse para identificar especies bacterianas que degradan residuos industriales y posiblemente generar subproductos valiosos. En este ejemplo, los investigadores investigaron cómo los medios de cultivo suplementados con licor negro, un producto de desecho de madera pulpa y papel producción, afectaron el crecimiento de una cepa microbiana ambiental.
Las bacterias no sólo demostraron mayor crecimiento con licor negro, sino que también demostraron un patrón de crecimiento "difásico", indicando la presencia de más de una fuente de carbono en licor negro que las bacterias pueden metabolizar. Componentes individuales del licor negro podrían entonces extraído para una más detallada análisis de crecimiento.
Finalmente, las mediciones de tasa de crecimiento también son útiles para la caracterización de las bacterias que han sido diseñadas para fines industriales particulares, por ejemplo, para la remediación de la contaminación por petróleo. Aquí, los científicos crearon genéticamente las cepas bacterianas que contienen enzimas para degradar los componentes de hidrocarburos del petróleo. Análisis de crecimiento se realizó, por ejemplo, para comprobar que las bacterias Ingeniería ha aumentado la tasa de crecimiento de las bacterias normales en la presencia de los hidrocarburos tóxicos, indicando mejor tolerancia que las bacterias diseñadas realizar su función de limpieza de la contaminación.
Sólo has visto video de Zeus en el análisis de las tasas de crecimiento bacteriano con las curvas de crecimiento. Ahora debe comprender las fases de crecimiento de cultivos bacterianos, cómo llevar a cabo un experimento para obtener una curva de crecimiento mediante dilución seriada galjanoplastia y colección de punto de tiempo, y cómo se pueden aplicar análisis de crecimiento para fines de investigación e industriales. ¡Como siempre, gracias por ver!
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Results
Después de una dilución seriada de la galjanoplastia experimento, se obtuvieron los siguientes datos. Al principio del crecimiento exponencial señalado aquí como el tiempo t = 0, la concentración inicial de células bacterianas es 1.000 ufc/mL. En el tiempo t = 6 h, la concentración de células es de 16.000 ufc/mL.
Ahora, X = 2n x X0
Donde: X0 = concentración inicial de células = 1.000 ufc/mL
X = concentración de células después de tiempo t = 16.000 ufc/mL
n = número de generaciones
16.000 = 2n x 1,000
2n = 16
sesión10 2n = log10 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301
Cuatro generaciones transcurrido en 6 h, así que
Tiempo de generación medio = 6/4 = 1.5 h.
Figura 4. Un nódulo de la raíz que contiene bacterias fijadoras de nitrógeno.
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Applications and Summary
Conocimiento de números bacteriano y cinética de crecimiento bacteriano en un medio de cultivo es importante de una investigación y el punto de vista comercial. En la investigación, a menudo es fundamental para conocer el número de bacterias en una muestra, por lo que el experimento puede repetirse, si fuera necesario, con los mismos números exactos. Por ejemplo, durante los experimentos en que se agregan inoculantes bacterianos a una parcela de tierra, un mínimo de 104 UFC deben añadirse por gramo de suelo para conseguir el efecto deseado, como mayor biodegradación de contaminantes tóxicos de suelo orgánico. Otro ejemplo es el caso de inoculantes rizobios producidos comercialmente, donde el conocido número de rizobios (bacterias que entran en relaciones simbióticas con las raíces de las plantas) está impregnado en un medio a base de turba de carbón (figura 4). El medio se utiliza para inocular semillas de leguminosas para mejorar la fijación biológica del nitrógeno (es decir, la conversión de nitrógeno molecular en formas orgánicas que puede ser utilizado por organismos como nutrientes).
Cinética de crecimiento también es útil para evaluar si particular cepas de bacterias están adaptadas para metabolizar ciertos sustratos, como desechos industriales o contaminación de aceite. Las bacterias que están genéticamente diseñadas para limpiar derrames de petróleo, por ejemplo, se pueden cultivar en presencia de complejos hidrocarburos para asegurar que su crecimiento no sería ser reprimido por los efectos tóxicos del petróleo. Del mismo modo, la pendiente y la forma de las curvas de crecimiento producido a partir de bacterias cultivadas con mezclas de residuos industriales pueden informar a los científicos si las bacterias pueden metabolizar la sustancia particular, y cuántas fuentes de energía potencial para las bacterias que pueden encontrarse en la mezcla de residuos.
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