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Analyse des courbes de croissance bactérienne et ses Applications pour l’environnement
 

Analyse des courbes de croissance bactérienne et ses Applications pour l’environnement

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Mesurer le taux de croissance des bactéries est une technique de microbiologie fondamentale et a usage répandu dans la recherche fondamentale ainsi que dans les applications agricoles et industrielles.

Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondants sur terre, étant présents dans chaque écosystème, y compris le corps humain. Certaines espèces bactériennes sont également génétiquement très docile et ont été exploités comme modèles de recherche ou pour fabriquer des produits naturels ou synthétiques à l’échelle industrielle. Cependant, pas toutes les espèces bactériennes peuvent être cultivées en laboratoire. Pour ceux qui peuvent, une caractéristique importante est le taux de multiplication, ou « cinétique de croissance ».

Mesurer le taux de croissance de la culture bactérienne peut informer les scientifiques sur leur physiologiques et métaboliques fonctionne et est également utile pour obtenir un nombre précis de cellules de la bactérie pour applications en aval.

Cette vidéo présentera les principes qui sous-tendent l’analyse du taux de croissance bactérienne, démontrer un protocole pour caractériser les taux de croissance avec une « courbe de croissance » et enfin, découvrir plusieurs applications de sciences de l’environnement pour mesurer la cinétique de croissance bactérienne.

Bactéries généralement se reproduisent asexuellement, multipliant par scissiparité simple où une seule cellule parentale se divise en deux cellules-filles identiques. Dans des conditions de croissance favorables où les nutriments sont disponibles en abondance et les paramètres environnementaux tels que la température sont tous propices à la croissance, le taux de multiplication dépasse de loin le taux de mortalité. Cela se traduit par une croissance exponentielle.

En mesurant la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps, une courbe de croissance peut être obtenue. Les bactéries dans un milieu de culture liquide dans des conditions optimales de croissance produit une courbe de croissance avec une forme caractéristique qui peut être divisée en différentes phases. La courbe commence par une « phase de latence », quand la croissance est lente, tandis que les bactéries deviennent acclimatés à des conditions de culture. Suivant est le « journal » ou « phase exponentielle de croissance », quand les bactéries connaître une croissance exponentielle. La croissance cale finalement une fois l’épuisement nutriments et déchets s’accumulent, ce qui entraîne une « phase stationnaire ». Enfin, une fois que le taux de multiplication est dépassé par le taux de mort cellulaire, la culture pénètre dans la « phase de mort ».

Pour construire une courbe de croissance, le nombre de bactéries dans un flacon de culture liquide est comptés à différents moments sur une certaine période de culture. La numération bactérienne peut être obtenue par un certain nombre de différentes méthodes. Une approche courante consiste à mesurer la densité optique - ou « OD » - 600, qui est l’absorbance de la solution bactérienne de la lumière à une longueur d’onde de 600 nm.

Une autre méthode consiste à déterminer le « UFC », ou les unités formant des colonies par millilitre de la culture. En raison de la nature clonale de la croissance bactérienne, une bactérie dans une culture peut théoriquement développer dans une colonie observable sur une gélose. Par une série de dilutions d’une culture bactérienne de placage pour atteindre une concentration bactérienne où les colonies discrets peuvent être observés, une méthode appelée « plating dilution en série », la numération des colonies peut être utilisée pour le dos-calculer la concentration bactérienne en termes d’UFC / mL.

Maintenant que vous comprenez comment la croissance bactérienne peut être analysée, Let ' s go via un protocole pour effectuer une analyse de courbe de croissance sur les cultures pures d’un modèle bien établi bactérien, Escherichia coli, à l’aide de l’électrodéposition méthode de dilution en série.

Un jour avant l’heure point collection, inoculer 20 mL de bouillon préstérilisé trypticase soja ou du BST, moyen dans un ballon jaugé de 50mL avec une seule colonie d’Escherichia coli.

Incuber la culture pendant une nuit à 37 ° C sous agitation. Pour e. coli, cela se traduirait par une population de phase stationnaire d’environ 109 UFC/mL.

Le lendemain, ensemencer 100 μL de la culture au jour le jour dans 250 mL de BST dans un ballon jaugé de 500 mL. Mélanger soigneusement. Il en résulte une culture diluée d’environ 4 x 105 UFC/mL. Stocker 5 mL de cette culture diluée dans un tube à culture. Il s’agit de l’aliquote de temps point 0 ou T0. Réfrigérer immédiatement à 4 ° C.

Incuber le volume restant de la culture à 37 ° C sous agitation. À toutes les heures par la suite pendant 8 h, recueillir des aliquotes de 5 mL de la culture. Désigner ces échantillons T1 T8et stocker la totalité d'entre eux à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

Le jour de l’expérience, enlevez les aliquotes de point de temps d’e. coli du réfrigérateur et mettez-les sur la glace. Microtubes stériles, chacune avec 900 μL de sérum physiologique stérile, permet de mettre en place une série de dilution pour chaque aliquote conformément au tableau suivant.

Mélange la culture de0 T bien au doucement Vortex, puis ajouter 100 μL de Tube A sa série de dilution, en faisant un 1 sur 10 ou 10-1 dilution. Tube de Vortex A mix, et à l’aide d’un embout de la pipette frais, ajouter 100 μL de Tube A du Tube B, faire le 1-en-100 ou 10-2 dilution.

Répétez le processus pour chaque culture aliquote et font de la série de dilution appropriée selon le tableau 2. Une fois la série de dilution pour tous les échantillons de point de temps ont été faites, le nombre de plaques d’agar stérile trypticase soja ont préparé pour ensemencement bactérien.

3 dilutions de chaque culture de point du temps vont être plaquées en trois exemplaires conformément au tableau suivant. Étiqueter les plaques en conséquence. Puis, pipette 100 μl de chaque culture convenablement dilué vers le centre de la gélose respectifs. Flamme-stériliser une baguette de verre en forme de « L ", cool en touchant la tige à l’agar loin de l’inoculum et immédiatement étaler le liquide sur la surface de la gélose. Veuillez noter que pourrait entraîner un retard dans la diffusion de la pullulation microbienne à l’endroit de l’inoculation.

Continuer l’électrodéposition de chaque série de dilution pour tous 9 fois point de cultures, le verre tige entre chaque série de dilution de propagation de flamme-stérilisation.

Une fois que les plaques ont été autorisés à sécher pendant quelques minutes, retournez et placez-les dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Après cette période de croissance, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C.

Après une nuit d’incubation des plaques dilution, examinez-les pour la contamination et l’uniformité des colonies. Pour chaque fois point culture, choisir une dilution pour laquelle il y a entre 30-300 colonies par boîte. Compter le nombre de colonies sur chacune des plaques en triple pour cette dilution.

En utilisant le nombre moyen de colonies pour chaque dilution et le facteur de dilution, calculer la concentration de bactéries dans la culture d’origine à chaque instant en UFC/mL. Par exemple, s’il y a en moyenne 30 colonies de la triple plaque ensemble issu de 0,1 mL de la 10-4, au 1-à-10 000, dilution, puis il serait 30 divisé par 0,1 mL multiplié par 10 000, soit 3 millions CFU/mL.

À l’aide de la concentration bactérienne calculée pour chaque point dans le temps, tracer la courbe du journal de la base 10 de la concentration bactérienne, en UFC/mL, contre le temps en heures. Sur le graphique, d’identifier la phase logarithmique de croissance de la culture d’origine bactérienne et de choisir deux points temps dans la phase logarithmique, qualifiant le premier de ces points dans le temps t = 0. Calculer la durée d’une génération moyenne à l’aide de l’équation X est égal à 2 à la puissance n multiplié par X0 où X est la concentration de bactéries au temps t, X0 est la concentration initiale à t = 0, et n est le nombre de générations qui s’est écoulé entre les deux points de temps.

Par exemple, supposons que X0 est 1 000 UFC/mL et à t = 6 h, que la concentration est de 16 000 UFC/mL. À l’aide de l’équation, nous obtenons que 4 générations ont eu lieu dans les 6 h, ce qui donne un temps de génération de 6 divisé par 4 ou 1,5 h par génération.

Mesure de la cinétique de croissance bactérienne est fondamentale pour de nombreuses applications pour la recherche, l’agriculture ou des fins de bio-ingénierie.

Une utilisation pour connaître le taux de croissance bactérienne est d’autoriser un montant précis d’une culture bactérienne à obtenir pour ensemencer une autre culture ou moyen. Par exemple, certaines cultures, comme les légumineuses, ont besoin d’être cultivées avec des bactéries symbiotiques connus comme les rhizobiums qui colonisent les racines de plantes à former des nodosités et « fixent » l’azote - convertir l’azote atmosphérique en ammoniac, qui peut être utilisé par la plante. Pour des applications agricoles, une quantité connue de rhizobiums est ajoutée à une moyenne de carbone à base de tourbe, qui est ensuite utilisé pour ensemencer les graines de légumineuses pour établir la symbiose plante-bactérie.

Analyse de la croissance permet également d’identifier les espèces bactériennes qui peuvent dégrader les déchets industriels et éventuellement générer des sous-produits utiles. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié comment les milieux de culture additionnés de la liqueur noire, un déchet de pâte de bois et la production de papier, affecté la croissance d’une souche microbienne environnementale.

Les bactéries non seulement démontré une croissance accrue avec la liqueur noire, mais ont également montrent un modèle de croissance « diphasique », indiquant la présence de plus d’une source de carbone dans la liqueur noire que les bactéries peuvent métaboliser. Les composants individuels de la liqueur noire pourraient alors été extraits pour plus d’analyse de la croissance.

Enfin, les mesures de taux de croissance sont également utiles pour caractériser les bactéries qui ont été conçus à des fins industrielles particulières, par exemple, pour l’assainissement de la pollution par les hydrocarbures. Ici, les scientifiques ont créé des souches de bactéries génétiquement modifiées qui contiennent des enzymes pour dégrader les composants d’hydrocarbures de pétrole. Analyse de la croissance a été réalisée, par exemple, pour vérifier que la bactérie machinée a augmenté les taux de croissance que les bactéries normales en présence des hydrocarbures toxiques, ce qui indique une tolérance accrue qui permettra les bactéries machinées de remplir leur fonction de nettoyage de la pollution.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’analyse des taux de croissance bactérienne avec des courbes de croissance. Vous devez maintenant comprendre les différentes phases de croissance des cultures bactériennes, comment réaliser une expérience afin d’obtenir une courbe de croissance à l’aide de la collection de points de temps et le placage de dilution en série, et comment l’analyse de la croissance peut être appliqué à des fins industrielles et de recherche. Comme toujours, Merci pour regarder !

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