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Bakterielle Wachstum Kurvenanalyse und seine Umweltanwendungen
 

Bakterielle Wachstum Kurvenanalyse und seine Umweltanwendungen

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Die Wachstumsrate der Bakterien zu messen ist eine grundlegende Technik, mikrobiologische und hat weit verbreiteten Einsatz in der Grundlagenforschung als auch landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen.

Bakterien sind unter den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde anwesend in jedem Ökosystem des menschlichen Körpers inklusive. Bestimmte Bakterienarten sind auch genetisch sehr gefügig und haben als Forschungsmodelle oder natürlichen oder synthetischen Produkten im industriellen Maßstab genutzt wurde. Allerdings können nicht alle Bakterienarten im Labor kultiviert werden. Für diejenigen, die können, ist ein wichtiges Merkmal der Multiplikation oder "Wachstum Kinetik".

Messung eine Bakterienkultur Wachstumsrate kann informieren Wissenschaftler über ihre physiologische und metabolische Funktionen und ist auch nützlich, um eine exakte Zellzahl der Bakterien für downstream-Anwendungen.

Dieses Video wird einzuführen, die Prinzipien hinter Bakterienwachstum Rate Analyse, ein Protokoll zur Charakterisierung Wachstumsrate mit einer "Wachstumskurve" zu demonstrieren und schließlich beschäftigen mehrere Umweltwissenschaften Anwendungen zur Messung von Bakterienwachstum Kinetik.

Bakterien vermehren in der Regel ungeschlechtlich, Multiplikation mit einfachen binären Kernspaltung wo eine elterliche Zelle teilt sich in zwei identische Tochterzellen. Unter günstigen Wachstumsbedingungen, wo Nährstoffe in Hülle und Fülle und Umweltparametern vorhanden sind, wie z. B. Temperatur sind alle förderlich für Wachstum, übertrifft die Rate der Multiplikation die Sterberate. Dies führt zu exponentiellem Wachstum.

Durch die Messung der Menge der Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit, erhalten Sie eine Wachstumskurve. Wachsenden Bakterien in einer flüssigen Kultur unter optimalen Bedingungen produziert eine Wachstumskurve mit eine charakteristische Form, die in verschiedene Phasen unterteilt werden kann. Die Kurve beginnt mit einer "Lag-Phase", als Wachstum langsam ist, während die Bakterien, die Kulturbedingungen eingewöhnt werden. Als nächstes ist die "Protokoll" oder "exponentielle Phase", wenn die Bakterien exponentielles Wachstum erleben. Wachstum Stände schließlich einmal Nährstoffe aufgebraucht werden und Schlacken ansammeln, was zu einer "stationären Phase". Schließlich, sobald die Rate der Multiplikation durch die Rate der Zelltod überholt ist, tritt die Kultur die "Tod-Phase".

Um einer Wachstumskurve zu konstruieren, sind bakterielle Zahlen in einem Kolben der Flüssigkultur über einen bestimmten Zeitraum der Kultivierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezählt. Bakterielle Grafen erhalten Sie durch eine Reihe von verschiedenen Methoden. Ein gemeinsamer Ansatz ist zu messen optische Dichte- oder "OD" - 600, ist die bakterielle Lösung Absorption von Licht bei einer Wellenlänge von 600 nm.

Eine weitere Methode ist die "CFU" oder Kolonie Bildenden Einheiten pro Milliliter der Kultur bestimmen. Aufgrund der klonalen Bakterienwachstum kann ein Bakterium in einer Kultur theoretisch in einem beobachtbaren Kolonie auf einer Nährbodenplatte expandieren. Durch eine Reihe von Verdünnungen eine Bakterienkultur Ausplattieren um eine bakterielle Konzentration zu erreichen, wo einzelne, diskrete Kolonien werden beobachtet, eine Methode namens "serielle Verdünnung Plating", die Anzahl der Kolonie kann verwendet werden, um die Bakterienkonzentration im Hinblick auf die KBE pro mL zurück zu berechnen.

Nun, da Sie verstehen wie Bakterienwachstum analysiert werden kann, gehen wir durch ein Protokoll für die Durchführung von Wachstum Kurvenanalyse auf Reinkulturen eines etablierten bakterielle Modells, Escherichia coli, die serielle Verdünnung plating-Methode verwenden.

Einen Tag vor der Zeit Punkt Sammlung, 20 mL vorsterilisierten Trypticase-Soja-Bouillon oder TSB, Medium in eine 50-mL-Flasche mit einer einzigen Kolonie von E. Colizu impfen.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln. Für E. Coli, würde dadurch in einer stationären Phase-Population von etwa 109 KBE/mL.

Impfen Sie am nächsten Tag 100 μL der Übernacht-Kultur in 250 mL TSB in einen 500-mL-Kolben. Mischen Sie gründlich. Dadurch entsteht eine verdünnte Kultur von ca. 4 x 105 KBE/mL. 5 mL dieser verdünnten Kultur in ein Kultur-Rohr zu speichern. Dies ist die Aliquote vom Zeitpunkt 0 oder T0. Kühlen Sie sofort bei 4 ° C.

Inkubieren Sie das restliche Volumen der Kultur bei 37 ° C mit schütteln. Zu jeder Stunde danach für bis zu 8 h sammeln Sie 5-mL-aliquoten aus der Kultur. Benennen Sie diese Proben T1 bis T8, und speichern Sie alle von ihnen bei 4 ° C bis zur Verwendung.

Am Tag des Experiments nehmen Sie die E. Coli Zeitpunkt Aliquote aus dem Kühlschrank und halten sie auf dem Eis. Verwenden Sie sterile Microfuge Röhren, jeweils mit 900 μl steriler Kochsalzlösung zum Einrichten einer Verdünnungsreihe für jedes aliquoten gemäß der folgenden Tabelle.

Mix T0 Kultur gut durch sanft aufschütteln, fügen 100 μL Rohr A seine Verdünnungsreihen, machen eine 1-in-10 oder 10-1 Verdünnung. Vortex Rohr A zu mischen und mit einem frischen Pipettenspitze 100 μL der Schlauch A hinzufügen Rohr B, so dass die 1 100 oder 10-2 Verdünnung.

Wiederholen Sie den Vorgang für jede Kultur aliquoten und stellen Sie die entsprechenden Verdünnungsreihen nach Tabelle 2. Sobald der Verdünnungsreihe für alle Zeitpunkt Proben vorgenommen wurden, müssen Sie die entsprechende Anzahl von sterilen Trypticase-Soja Agarplatten für bakterielle Beschichtung vorbereitet.

3 Verdünnungen der jeweiligen Zeit-Punkt-Kultur werden in dreifacher Ausfertigung gemäß der folgenden Tabelle überzogen. Beschriften Sie die Platten entsprechend. Dann pipette 100 μL jeder entsprechend verdünnten Kultur in die Mitte des jeweiligen Nährbodenplatte. Flamme-sterilisieren "L"-förmige Glasstab kühl durch die Rute auf dem Agar entfernt das Inokulum berühren und sofort die Flüssigkeit über die Agar-Oberfläche verteilt. Bitte beachten Sie, dass eine Verzögerung bei der Verbreitung von bakterielle Überwucherung an der Stelle der Inokulation führen könnte.

Weiter Beschichtung jeder Verdünnungsreihen für alle 9 Zeit Punkt Kulturen, Flamme-Sterilisierung des Glases, die Rute zwischen den einzelnen Serien Verdünnung zu verbreiten.

Sobald die Platten erlaubt haben, ein paar Minuten trocknen lassen, drehen Sie und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator 37 ° C. Nach dieser Zeit des Wachstums können Platten bei 4 ° c gelagert werden

Untersuchen sie nach der Übernachtung Inkubation der Verdünnung Platten für Verunreinigungen und Einheitlichkeit der Kolonien. Punkt für jedes Mal Kultur, wählen Sie eine Verdünnung für die gibt es zwischen 30-300 Kolonien pro Platte. Die Anzahl der Kolonien auf jedem der dreifacher Platten für die Verdünnung.

Berechnen Sie die mittlere Anzahl der Kolonien für jede Verdünnung und den Verdünnungsfaktor verwenden, die Konzentration von Bakterien in der ursprünglichen Kultur zu jedem Zeitpunkt in KBE/mL. Beispielsweise würde gibt es im Durchschnitt 30 Kolonien aus der dreifacher Platte Satz von 0,1 mL 10-4oder 1 in 10.000, Verdünnung, dann es 30 von 0,1 mL multipliziert mit 10.000 oder 3 Millionen KBE/mL aufgeteilt werden.

Mit Hilfe der Bakterienkonzentration berechnet für jeden Zeitpunkt, zeichnen ein Diagramm der Logarithmus Base-10 die Bakterienkonzentration in KBE/mL, gegen die Zeit in Stunden. Aus dem Diagramm die Log-Phase des Wachstums von der ursprünglichen Bakterienkultur identifizieren und wählen Sie zwei von den Zeitpunkten innerhalb der Log-Phase, Benennung der ersteres der diese Zeitpunkte als t = 0. Berechnen Sie die mittlere Generationszeit unter Verwendung der Gleichung X ist gleich 2 hoch n multipliziert mit X0 , wobei X die Bakterienkonzentration zum Zeitpunkt t, X0 ist, ist die Ausgangskonzentration bei t = 0, und n ist die Anzahl von Generationen, die zwischen den beiden vergangen ist Zeit Punkte.

Z. B. angenommen, X0 1.000 KBE/mL ist, und bei t = 6 h, die Konzentration beträgt 16.000 KBE/mL. Unter Verwendung der Gleichung, erhalten wir, dass innerhalb von 6 h 4 Generationen aufgetreten sind, verleiht eine Generationszeit von 6 geteilt durch 4 oder 1,5 h pro Generation.

Messung von Bakterienwachstum Kinetik ist grundlegend für viele Anwendungen für Forschung, Landwirtschaft oder Bioingenieurwesen Zwecke.

Eine Verwendung für das bakterielle Wachstum wissen ist erlauben eine genaue Menge an eine Bakterienkultur eingeholt werden, um eine andere Kultur oder Medium zu impfen. Beispielsweise müssen bestimmte Kulturen, wie Hülsenfrüchte, mit symbiontischen Bakterien bekannt als Rhizobien angebaut werden, die die Pflanzen Wurzeln in Form Knötchen zu kolonisieren und "fix" Stickstoff - Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak, die von der Pflanze genutzt werden können. Für landwirtschaftliche Anwendungen wird eine bekannte Menge von Rhizobien Torf-basierten Carbon Medium, hinzugefügt, die dann verwendet wird, Leguminosen-Samen um die Pflanze-bakterielle Symbiose herzustellen zu impfen.

Wachstum Analyse kann auch zur bakteriellen Spezies zu identifizieren, die erniedrigen Industrieabfälle und möglicherweise wertvolle Nebenprodukte erzeugen können. In diesem Beispiel untersuchten Forscher, wie Wachstumsmedien ergänzt mit Schwarzlauge, ein Abfallprodukt aus Holz zerdrücken und Papierherstellung, das Wachstum der Umwelt mikrobielle Isolat betroffen.

Die Bakterien nicht nur verbesserte Wachstum mit Schwarzlauge gezeigt, sondern zeigte auch ein "zweiphasigen" Wachstumsmuster, auf das Vorhandensein von mehr als einer Kohlenstoffquelle in Schwarzlauge, die die Bakterien verstoffwechseln können. Einzelne Komponenten der Schwarzlauge könnte dann ausführlichere Wachstum Analyse extrahiert wurden.

Wachstum Messungen eignen sich schließlich auch für die Charakterisierung von Bakterien, die für bestimmte industrielle Zwecke, z. B. für Sanierung der Ölverschmutzung entwickelt haben. Hier entstehen Wissenschaftler gentechnisch Bakterienstämme, die Enzyme um die Kohlenwasserstoff-Komponenten des Öls erniedrigen enthalten. Z. B. wurde Wachstum Analyse durchgeführt, um sicherzustellen, dass die veränderten Bakterien gestiegen Wachstumsrate als normalen Bakterien im Beisein der giftige Kohlenwasserstoffe, verbesserte Toleranz, mit denen die veränderten Bakterien ihre Verschmutzung Bereinigung Aufgabe angibt.

Sie haben nur Jupiters Video auf die Analyse bakterieller Wachstumsraten mit Wachstumskurven angesehen. Sie sollten jetzt verstehen die unterschiedlichen Wachstumsphasen der Bakterienkulturen, gewusst wie: führen Sie ein Experiment, um einer Wachstumskurve mit Punkt Zeitgebühr und serielle Verdünnung Überzug zu erhalten und wie Wachstum Analyse, Forschung und industrielle Zwecke angewendet werden kann. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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