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細菌の成長曲線の解析と環境応用

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細菌の成長率を測定基礎微生物学的手法は、広範な使用は、基礎研究だけでなく農業および産業用アプリケーションのように。

細菌は地球の全ての生態系に存在することの最も豊富な生命体の中で人間の体を含んでいます。特定の細菌種はまた遺伝的非常に扱いやすい、工業規模での天然または合成の製品を生産、研究モデルとして利用されました。ただし、ラボでない全ての菌種を培養することができます。これらは、ことができます、重要な特徴は乗算、または「成長カイネティクス」の割合です。

細菌文化の成長率を測定する知らせることができます科学者の生理・代謝機能、また、下流用細菌のセルの正確な数を取得するために役立ちます。

このビデオは細菌の増殖率の分析の背後にある原則を導入するが、「成長曲線」の成長率を評価するためプロトコル示すし、最後に、細菌の増殖動態を測定するためのいくつかの環境の科学アプリケーションを探索。

細菌は一般的に 1 つの親細胞が同じ 2 つの娘細胞に分割単純な裂を掛ける、無性別します。栄養素が豊かさと環境パラメーターで使用可能な温度は、すべての成長を促すなど、良好な成長条件下で乗算の速度はこれまで死亡率を超えています。急激な成長でこの結果します。

文化の中の細菌の量を時間の関数として測定することにより成長曲線が得られます。最適な条件下で液体培養で細菌の成長のさまざまなフェーズに分けることが特徴的な形状と成長曲線を生成します。カーブは細菌培養条件に慣れながら成長が遅いとき「ラグ フェーズ」に始まります。次に、「ログ」または「指数段階」、細菌が急激な成長を経験するときです。成長には、栄養素が枯渇になるし、老廃物がたまり、「静止した段階」の結果最終的に失速します。最後に、細胞死の率の積率を抜いて、一度文化は「死の段階」を入力します。

成長曲線を構築するには、液体培養のフラスコの中の細菌の数が一定期間培養の異なる時点でカウントされます。細菌数は、いくつかの異なる方法で取得できます。一般的な方法の 1 つは光学密度または"OD"- 600、600 の波長の光の細菌の解決の吸光度は測定する nm。

別の方法は、「CFU」、または文化の 1 ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定することです。細菌の増殖のクローンの性質のため文化の 1 つの細菌を寒天版の 1 つのオブザーバブル コロニーに理論的に展開できます。細菌文化の希薄のシリーズをメッキすることによって、「シリアル希釈めっき」と呼ばれるメソッドを観察個々 で独立したコロニーをすることができます細菌濃度に到達する、コロニー数は 1 mL あたり CFU の面で細菌濃度をバック計算することが使用できます。

今、あなたが理解して細菌の増殖を分析できる老舗細菌エシェリヒア属大腸菌モデルの純粋な文化の成長曲線の分析を行うためのプロトコルを行ってみましょうどのようにシリアル希薄をめっき法を使用して。

ポイント コレクションに時間の前に 1 日、殺菌済みトリプチ醤油スープや TSB、エシェリヒア属大腸菌の単一コロニーを 50 mL のフラスコで培地 20 mL を接種します。

揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。エシェリヒア属大腸菌、これは約 10 の固定相の人口になる9 CFU/mL。

次の日は、500 mL のフラスコで TSB の 250 mL に一晩かけて培養の 100 μ L を接種します。ミックス徹底的。これは約 4 x 105 CFU/mL の希釈文化を生成します。カルチャ チューブにこの希釈文化の 5 mL を格納します。これは、時点 0 または T0から因数です。4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やします

揺れで 37 ° C で文化の残りのボリュームを孵化させなさい。8 h までの後のすべての時間、文化から 5 ml を収集します。これらサンプル T1 T8を指定し、使用するまで 4 ° C でそれらのすべてを格納します。

実験の日、冷蔵庫から大腸菌時間ポイント因数を削除し、氷のそれらを保ちます。それぞれ 900 μ L の滅菌生理食塩水、滅菌 microfuge の管を使用して、次の表に従って各因数の希釈系列を設定します。

ミックス軽くボルテックスでよく T0文化は、その希釈系列の 1-で-10、または 10-1希釈を作るチューブ A に 100 μ L を追加します。渦管 A、ミックスし、新鮮なピペット チップを使用して管 b、100 で 1 または 10-2希釈を作るチューブ A の 100 μ L を追加します。

表 2 に従って適切な希釈系列をして因数カルチャごとにプロセスを繰り返します。一度すべての時間ポイントのサンプルの希釈系列が行われている無菌トリプチ大豆寒天版の細菌のめっきの準備の適切な数であります。

各時間ポイント文化の 3 希釈液は次の表に従って 3 通でメッキされます。それに応じてプレートをラベル付けします。その後、それぞれ寒天プレートの中央に適切に希釈したカルチャごとの 100 μ L をピペットします。炎-滅菌"L"型のガラス棒、クール、接種から寒天をロッドに触れるとすぐに液を寒天培地の表面に 。接種の場所で細菌の増殖、拡散の遅延が生じるのでご注意ください。

すべての 9 の各希釈系列をめっきを続けるポイント文化、各希釈系列間ロッドを拡散ガラスを火炎滅菌の時間します。

プレートは、数分間乾燥するために許可されている、一度反転し、37 ° C の定温器に一晩置いてください。成長のこの期間の後、プレートは 4 ° C で格納できます。

希釈平板の一晩インキュベートした後汚染とコロニーの均一性にそれらを確認します。たびにポイントの文化のプレートごと 30 300 コロニー間ある希釈を選ぶ。その希釈用帳票のプレートのそれぞれのコロニーの数をカウントします。

各希釈し、希釈倍率のコロニー数の平均を使用して、CFU/mL の各時点で元のカルチャにおける細菌の濃度を計算します。たとえば、平均 30 植民地、3 通からプレート セット 10-4、0.1 mL から得られたまたは 10,000 の 1、希釈しそこがある場合 30 で割ること 0.1 mL 10,000、または 300 万 CFU/mL を掛けた。

各時点の計算細菌濃度を使用して、時間の時間に対して CFU/mL に、細菌の濃度の基本 10 ログのグラフをプロットします。グラフから元の細菌文化の成長のログ段階を識別し、t としてこれらの時間ポイントの最初を指定するログ段階の時間ポイントの 2 つを選んで 0 を =。計算式 X を使用して平均世代時間に等しい 2 n倍を乗じた力0 X は0 X の時間 t における細菌の濃度は t 初期濃度 = 0、n は 2 つの間に経過した世代数とタイム ポイント。

たとえば、X0は 1,000 CFU/mL と仮定します、t = 6 h で、濃度は 16,000 CFU/mL。式を使用して、我々 は 4 世代が 6 h、6 世代あたり 4 または 1.5 h で割った値の生成時間を与えるに行われていることを取得します。

細菌の増殖速度の測定は研究、農林やバイオ エンジニア リングの目的のための多くのアプリケーションに不可欠です。

細菌の増殖速度を知るための 1 つの使用は、別のカルチャまたは培地に接種を取得して細菌培養の正確な量を許可することです。たとえば、特定の作物, マメ科植物などはフォーム結節に植物の根を植民地化し、「修正」窒素 - 大気中の窒素を植物によって利用することができますアンモニアに変換する根粒菌と呼ばれる共生細菌に成長する必要があります。農業用には、根粒菌の既知量は植物細菌の共生を確立するマメ科植物種子を接種するものですし、泥炭基づく炭素中に追加されます。

生長解析は、産業廃棄物が低下し、必要な貴重な副産物を生成する細菌の種を識別するためにも使用できます。この例では、研究者は、成長培地黒液、木材パルプおよびペーパー生産から廃棄物が環境微生物分離株の成長に影響を検討しました。

細菌だけでなく、黒液と強化された成長を示したこと、また細菌の代謝することができます黒の液で 1 つ以上の炭素源の存在を示す「ダイフェーズ」成長パターンを示した。黒液の個々 のコンポーネントがその成長解析の詳細に抽出されています。

最後に、成長率測定もたとえば、油汚染の浄化として特定工業用設計されている細菌の特性評価に役立ちます。ここでは、科学者たちは、石油の炭化水素成分を低下させる酵素を含む遺伝子組み換え細菌の緊張を作成しました。生長解析は組み換え細菌組み換え細菌汚染クリーンアップ機能を行うようになります改善の公差を示す有害な炭化水素の存在下での正常な細菌よりも成長率が増加していることを確認するために実行されます。

成長曲線と細菌の増殖率の分析にゼウスのビデオを見てきただけ。今細菌文化、時間ポイント コレクションとシリアル希釈めっきを使用して成長曲線を取得する実験を実行する方法および研究および産業目的のための成長分析の適用方法の異なる成長段階を理解する必要があります。いつも見てくれてありがとう!

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