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Análisis de la curva de crecimiento bacteriano y sus aplicaciones ambientales
 

Análisis de la curva de crecimiento bacteriano y sus aplicaciones ambientales

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Medir la tasa de crecimiento de las bacterias es una técnica microbiológica fundamental, y tiene amplio uso en investigación básica, así como en aplicaciones agrícolas e industriales.

Las bacterias están entre las más abundantes formas de vida en la tierra, estando presente en cada ecosistema, incluyendo el cuerpo humano. Ciertas especies bacterianas también son genéticamente muy manejables y han sido utilizados como modelos de investigación o para producir productos naturales o sintéticos a escala industrial. Sin embargo, no todas las especies bacterianas pueden ser cultivadas en el laboratorio. Para aquellos que pueden, una característica importante es la tasa de multiplicación, o "cinética de crecimiento".

Medir la tasa de crecimiento de un cultivo bacteriano puede informar a los científicos sobre sus fisiológicos y metabólicos funciona y también es útil para obtener un número exacto de la célula de las bacterias para aplicaciones posteriores.

Este video introducir los principios del análisis de la velocidad de crecimiento bacteriano, demostrar un protocolo para la caracterización de la tasa de crecimiento con una "curva de crecimiento" y por último, explorar varias aplicaciones de la ciencia ambiental para medir la cinética de crecimiento bacteriano.

Las bacterias generalmente reproducen asexualmente, multiplicándose por simple fisión binaria donde una célula parental se divide en dos células hijas idénticas. Bajo condiciones de crecimiento favorables donde nutrientes están disponibles en abundancia y parámetros ambientales como temperatura, son todo propicio para el crecimiento, la tasa de multiplicación excede la tasa de mortalidad. Esto resulta en un crecimiento exponencial.

Midiendo la cantidad de las bacterias en un cultivo en función del tiempo, puede obtenerse una curva de crecimiento. Cultivo de bacterias en un cultivo líquido en condiciones óptimas produce una curva de crecimiento con una forma característica que se puede dividir en varias fases. La curva comienza con una "fase de retraso", cuando el crecimiento es lento mientras que las bacterias se aclimataron a las condiciones de cultivo. El siguiente es el "registro" o "fase exponencial", cuando la bacteria experimenta un crecimiento exponencial. Crecimiento se detiene eventualmente agotarse nutrientes y productos de desecho se acumulan, resultando en una "fase estacionaria". Por último, una vez que la tasa de multiplicación es superada por la tasa de muerte celular, la cultura entra en la fase de"muerte".

Para construir una curva de crecimiento, se cuentan números bacterianos en un matraz de cultivo líquido en diferentes puntos temporales durante un periodo de cultivo. Conteos bacterianos pueden obtenerse por varios métodos diferentes. Un enfoque común es para medir la densidad óptica - o "OD" - 600, que es la absorbancia de la solución bacteriana de la luz en una longitud de onda de 600 nm.

Otro método es determinar la "UFC", o unidades formadoras de colonias, por mililitro de la cultura. Debido a la naturaleza clonal del crecimiento bacteriano, una bacteria en una cultura puede expandir teóricamente en una colonia observable en una placa de agar. Por una serie de diluciones de un cultivo bacteriano de la galjanoplastia alcanzar una concentración bacteriana donde las colonias individuales, discretas pueden ser observado, un método llamado "placas de la dilución serial", el recuento de colonias se puede utilizar para la espalda-calcular la concentración bacteriana en términos de UFC / mL.

Ahora que usted comprende cómo crecimiento bacteriano puede ser analizado, vamos a ir a través de un protocolo para la realización de análisis de la curva de crecimiento en cultivos puros de un modelo bien establecido bacteriano, Escherichia coli, usando la dilución serial método.

Un día antes de la hora punto de colección, sembrar 20 mL de caldo de soja trypticase preesterilizadas o TSB, medio en un matraz de 50mL con una sola Colonia de e. coli.

Incubar el cultivo durante la noche a 37 ° C con agitación. Para e. coli, esto resultaría en una población de fase estacionaria de aproximadamente 109 UFC/mL.

Al día siguiente, inocular 100 μL de la cultura durante la noche en 250 mL de TSB en un matraz de 500 mL. Mezclar bien. Esto produce una cultura diluida de aproximadamente 4 x 105 UFC/mL. Almacenar 5 mL de esta cultura diluida en un tubo de cultivo. Esta es la parte alícuota de un punto de tiempo 0 y T0. Inmediatamente refrigerar a 4 ° C.

Incubar el volumen restante de la cultura a 37 ° C con agitación. Cada hora después de 8 h, recogen alícuotas de 5 mL de la cultura. Designar estas muestras T1 a T8y guarde todos ellos a 4 ° C hasta su uso.

En el día del experimento, sacar las alícuotas de punto de tiempo de e. coli de la nevera y mantener en hielo. Utilice los tubos del microfuge estériles, cada una con 900 μL de solución salina estéril, para configurar una serie de diluciones de cada alícuota según la siguiente tabla.

Mezcla la cultura de0 T bien por suavemente Vortex, añada 100 μL al tubo de la serie de diluciones, realizar un 1 en 10, o 10-1 dilución. Tubo vórtice a la mezcla y utilizando una nueva pipeta, añada 100 μL del tubo al tubo B, haciendo el 1 en 100, o 10-2 dilución.

Repita el proceso para cada alícuota de cultivo y hacen que la serie de la dilución según la tabla 2. Una vez que se han hecho la serie de diluciones para todas las muestras de punto de tiempo, tienen el número adecuado de placas de agar de soja trypticase estéril preparado para placas bacterianas.

3 diluciones de cada cultura de punto de tiempo se plateó por triplicado según la siguiente tabla. Etiqueta de las placas en consecuencia. Entonces, Pipetee 100 μL de cada cultivo adecuadamente diluida en el centro de la placa de agar respectivos. Llama-esterilizar una varilla de vidrio en forma de "L", fresco al tocar la barra para el agar de inóculo y difundir inmediatamente el líquido sobre la superficie del agar. Tenga en cuenta que una demora en la divulgación podría resultar en el sobrecrecimiento bacteriano en el lugar de la inoculación.

Continuar plateando cada serie de dilución para los 9 punto de culturas, el vidrio separarse barra entre cada serie de dilución se llama esteriliza el tiempo.

Una vez que las placas se deja secar durante unos minutos, invertir y colocarlos en la incubadora de 37 ° C durante la noche. Después de este período de crecimiento, las placas pueden almacenarse a 4 ° C.

Después de la incubación de las placas de la dilución, examínelos para contaminación y uniformidad de las colonias. Cada vez el punto cultura, elegir la dilución que se encuentran entre 30-300 colonias por placa. Contar el número de colonias en cada una de las placas por triplicado para esa dilución.

El número medio de colonias para cada dilución y el factor de dilución, calcular la concentración de bacterias en la cultura original en cada punto de tiempo en UFC/mL. Por ejemplo, si hay en promedio 30 colonias de la triplicado placa conjunto obtenida de 0,1 mL de la 10-4, o 1 en 10.000, dilución, entonces allí sería 30 dividido por 0,1 mL multiplicado por 10.000, o 3 millones UFC/mL.

Utilizando la concentración bacteriana calculado para cada punto del tiempo, una gráfica del log base 10 de las concentraciones de bacterias, en UFC/mL, contra el tiempo en horas. En el gráfico, identificar la fase logarítmica de crecimiento de la cultura bacteriana original y escoger dos de los puntos del tiempo dentro de la fase de registro, que el primero de estos puntos de tiempo t = 0. Calcular el tiempo de generación malo usando la ecuación de X es igual a 2 a la potencia de n multiplicado por X0 donde X es la concentración bacteriana en el tiempo t, X0 es la concentración inicial en t = 0, y n es el número de generaciones que ha transcurrido entre los dos puntos de tiempo.

Por ejemplo, supongamos que X0 es de 1.000 ufc/mL y en t = 6 h, que la concentración es de 16.000 ufc/mL. Utilizando la ecuación, obtenemos que 4 generaciones han ocurrido dentro de las 6 h, que da un tiempo de generación de 6 dividido por 4 o 1.5 h por generación.

Medición de la cinética de crecimiento bacteriano es fundamental para muchas aplicaciones para fines de bioingeniería, la agricultura o la investigación.

Un uso para conocer la tasa de crecimiento bacteriano es permitir una cantidad precisa de un cultivo bacteriano obtenido para sembrar otro cultivo o medio. Por ejemplo, ciertos cultivos, como leguminosas, necesitan cultivarse con bacterias simbióticas conocidas como rizobios que colonizan las raíces de las plantas a los nódulos de la forma y "fijan" el nitrógeno - conversión de nitrógeno atmosférico en amoniaco, que puede ser utilizado por la planta. Para aplicaciones agrícolas, se agrega una cantidad conocida de rizobios a un medio a base de turba de carbón, que se utiliza para inocular semillas de leguminosas para establecer la simbiosis planta-bacteriana.

Análisis de crecimiento también pueden utilizarse para identificar especies bacterianas que degradan residuos industriales y posiblemente generar subproductos valiosos. En este ejemplo, los investigadores investigaron cómo los medios de cultivo suplementados con licor negro, un producto de desecho de madera pulpa y papel producción, afectaron el crecimiento de una cepa microbiana ambiental.

Las bacterias no sólo demostraron mayor crecimiento con licor negro, sino que también demostraron un patrón de crecimiento "difásico", indicando la presencia de más de una fuente de carbono en licor negro que las bacterias pueden metabolizar. Componentes individuales del licor negro podrían entonces extraído para una más detallada análisis de crecimiento.

Finalmente, las mediciones de tasa de crecimiento también son útiles para la caracterización de las bacterias que han sido diseñadas para fines industriales particulares, por ejemplo, para la remediación de la contaminación por petróleo. Aquí, los científicos crearon genéticamente las cepas bacterianas que contienen enzimas para degradar los componentes de hidrocarburos del petróleo. Análisis de crecimiento se realizó, por ejemplo, para comprobar que las bacterias Ingeniería ha aumentado la tasa de crecimiento de las bacterias normales en la presencia de los hidrocarburos tóxicos, indicando mejor tolerancia que las bacterias diseñadas realizar su función de limpieza de la contaminación.

Sólo has visto video de Zeus en el análisis de las tasas de crecimiento bacteriano con las curvas de crecimiento. Ahora debe comprender las fases de crecimiento de cultivos bacterianos, cómo llevar a cabo un experimento para obtener una curva de crecimiento mediante dilución seriada galjanoplastia y colección de punto de tiempo, y cómo se pueden aplicar análisis de crecimiento para fines de investigación e industriales. ¡Como siempre, gracias por ver!

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