ניתוח RNA של דגימות סביבתיות באמצעות RT-PCR

תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך, או RT-PCR, מאפשרת זיהוי של וירוסי RNA וביטוי גנים מיקרוביאליים בסביבה.

שלא כמו אורגניזמים תאיים מבני אדם ועד חיידקים, המשתמשים בדנ"א כחומר הגנטי שלהם, יש וירוסים מסוימים שיש להם גנומים העשויים מרנ"א, כולל וירוסים פתוגניים רבים כגון שפעת, אבולה ו- HIV. בעוד וירוסים מסוימים ניתן לזהות על ידי התבוננות פנוטיפ פתוגניים המתפתח כאשר נעשה שימוש להדביק תאים בתרבית התא, לרוב אין שיטות אפיון מבוססות תרבות. RT-PCR יכול לשמש כדי לזהות את נוכחותם של וירוסים אלה בסביבה עם רגישות גבוהה.

יחד עם זאת, אורגניזמים עם גנומים מבוססי DNA "מבטאים" את המידע הגנטי המקודד בגנומי ה- DNA שלהם על ידי "תעתיק" אותם לשליח או "m"RNA, אשר לאחר מכן ניתן "לתרגם" לחלבונים כדי לבצע תפקוד אנזימטי או מבני בתאים. כאשר חיידקים מגיבים ומסתגלים לשינויים בסביבה על ידי הפעלה או כיבוי של מסלולים גנטיים שונים, ניתן להשתמש ב- RT-PCR כדי לעקוב אחר שינויים כאלה בביטוי גנים כדי לשמש שמאי מערכת אקולוגית פוטנציאליים.

וידאו זה יעבור על העקרונות שמאחורי RT-PCR, יתווה הליך כללי לביצוע טכניקה זו, ולבסוף, יבחן כמה מהדרכים שבהן שיטה זו מיושמת במיקרוביולוגיה סביבתית כיום.

ישנם שני חלקים מרכזיים בהליך זה: הפקת RNA מדגימות ביולוגיות, ואחריו התמלול ההפוך שלו לדנ"א.

הבידוד של RNA כרוך lysing תאים במדגם על ידי הוספת חומר ניקוי שמפרק שומנים וחלבונים, ואחריו הפרעה מכנית. חילוץ RNA מווירוסים דורש בדרך כלל תוספת של חלבונים, שהם אנזימים מעכלי חלבונים, כדי לפרק את הקפסידים של הנגיפים - מעילי החלבון הקשוחים היוצרים את החלקיק הנגיפי. מצד שני, בעת קבלת RNA מאורגניזמים תאיים, ייתכן שיהיה צורך לטפל ב- lysate באנזימים משפילים לדנ"א, או DNAases, כדי למנוע תוצאות במורד הזרם להיות מבולבל על ידי נוכחות של DNA דומה מבחינה כימית.

לאחר מכן ניתן לטהר את הרנ"א מליסאטים באחת משתי דרכים. בשיטה אחת, המכונה חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם מיצוי, ליסאט מעורבב עם תערובת אורגנית-מימית כי הוא אז צנטריפוגה כדי להפריד את השלבים. חלבונים יחלקו לשלב האורגני, פסולת תאים תותבת לתוך אינטרפאזה מעונן, וחומצות גרעין לתוך השלב מימי. השלב מימי העליון ניתן לאסוף לאחר מכן, וRNA הוא מזועזז על ידי תוספת של אלכוהול כגון איזופרופנול, אשר מקטין את המסיסות של חומצת הגרעין במים.

בבידוד RNA מבוסס טורים, lysate מעורבב עם אלכוהול ולאחר מכן עבר דרך עמוד סינון ג'ל עם שרף טעון שלילית, כגון סיליקה. הליסאט מוכן כך שיונים טעונים באופן חיובי בצורת חיץ "גשרי מלח" המאפשרים לעמוד השדרה הפוספט הטעון השלילי של חומצות גרעין להיקשר לשרף. כל המזהמים האחרים נשטפים לאחר מכן. חומצות הגרעין "נלבות" מהעמוד באמצעות חיץ או מים בעלי מלח נמוך. מכיוון שלרנ"א חד-גדילי יש פחות מטענים שליליים מאשר לדנ"א דו-גדילי, ניתן לחמוק ממנו באופן מועדף באמצעות מאגרים של ריכוזים ספציפיים.

לאחר בידוד, הרנ"א הופך לדנ"א יציב יותר מבחינה כימית. מדענים רתמו אנזים המקודד באופן טבעי על ידי רטרווירוסים כמו HIV. אנזים זה ידוע בשם תמלול הפוך, או "RT".

RT מסונתז משלים או "c"DNA מרצועת קצרה של נוקלאוטידים המכונה פריימר. פריימר זה יכול להיות רצפים שונים, בהתאם למטרת הניסוי. לדוגמה, פריימר יכול להיות מתוכנן יש רצף מסוים, על מנת לזהות גנים ספציפיים או אורגניזמים. לאחר מסונתז, זה "גדיל ראשון" cDNA יכול להיות מוגבר על ידי PCR רגיל.

עכשיו שיש לנו הבנה של העקרונות מאחורי RT-PCR, בואו נסתכל על פרוטוקול לביצוע טכניקה זו על דגימות RNA שנאספו מהסביבה.

כדי להתחיל בהליך, מצא מיקום איסוף לדוגמה באמצעות קואורדינטות GPS או מראה. בחר נקודות אקראיות בתוך אזור כדי לקבל סקר כללי של בתי גידול מיקרוביאליים.

כדי לאסוף את המדגם המוצק, לדחוף ולסובב את היד auger לתוך הקרקע עד לעומק קבוע מראש. כאשר האוגר מורם, ניתן למצוא אדמה בתוך הגבעול החלול של האוגר.

אדמה זו מגרדת ישירות לתוך שקית איסוף קרקע ואת התיק מסומן עם המיקום, שם, תאריך, שעת האיסוף וכל מידע נחוץ אחר.

מעבירים את הקרקע למעבדה ומעבירים את האדמה דרך מסננה 2 מ"מ כדי להסיר חצץ וסלע. לנתח מדגם של הקרקע עבור תוכן לחות, אשר יכול להיות אינפורמטיבי על רמת הפעילות המיקרוביאלית בקרקע. כדי לעשות זאת, עיין בסרטון של אוסף זה "קביעת תכולת הלחות של האדמה".

לאיסוף דגימות מים, בחרו אתר מעניין הדומה לאיסוף קרקעות, ואוספים מים לבקבוק פלסטיק סטרילי עם קירות עבים. שים לב לנפח המים שנאספו. בדוק את המים באופן מיידי עבור פרמטרים כמו טמפרטורה, pH, ומליחות, אשר יכול לספק מידע חשוב על רמות מיקרוביאלי צפוי במדגם. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק בצידנית ומעבירים למעבדה.

מיקרואורגניזמים כגון וירוסים נאספים ומרוכזים מהדגימה הסביבתית.

ניתן לחלץ RNA מהוירוסים שנאספו בשיטת טור הספין באמצעות ערכות חילוץ RNA מסחריות בהתאם להוראת היצרן. חיץ ליזה, בתוספת אתנול, מעורבב תחילה עם המדגם. מקם את המספר המתאים של עמודות ספין בצינורות איסוף ולאחר מכן החל את הדגימות על מטריצת העמודות. צנטריפוגות העמודות בערך 12,000 x g במשך 1-2 דקות כדי לתת חומצות הגרעין להיקשר לעמוד, ולהשליך את הזרימה הנוזלית דרך.

הוסף שוב מאגר כביסה לעמודים וצנטריפוגה. מקם את העמודים לתוך צינורות מיקרופוגה הידבקות נמוכה חדשים סטריליים 1.5 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף מים כי הוא ללא RNases, שהם אנזימים להשפיל RNA, לעמודים צנטריפוגה במשך 30 s כדי לחמוק RNA. ניתן לאחסן את הרנ"א הנלהב ב-80 °C (80 °F) עד לשימוש.

לפני הניסוי, פריימרים מתאימים צריכים להיות מתוכננים על מנת לזהות את רצפי העניין, אשר יכול לשמש סמנים לנוכחות של מיקרואורגניזמים ספציפיים.

מוציאים את ריאגנטים RT המאוחסנים ב -20 °C (70 °F), ולהפשיר את ריאגנטים קפואים על קרח (או בטמפרטורת החדר). אלה כוללים נוקלאוטידים, מאגר תמלול הפוך, פריימרים. לאחר שהופשר, שמור את ריאגנטים על קרח; האנזים הפוך תמלול, מעכב RNase תמיד צריך להישמר על קרח.

בעוד ריאגנטים מפשירים, לחשב את הנפחים והריכוזים של מרכיבי התגובה. לאחר ריאגנטים מופשרים, מערבולת בעדינות לסובב כל צינור כדי להבטיח את התוכן מעורב היטב.

עבודה במכסה המנוע של זרימת למינאר כדי למנוע זיהום, להרכיב את הרכיבים בתערובת מאסטר להוסיף לכל צינור PCR. בעת הרכבת תערובת האב בצינור אפנדורף, הקפד לשנות טיפים pipette בין כל ריאגנט כדי למנוע זיהום. אחרי כל הריאגנטים נוספו לצינור אפנדורף, מערבולת בעדינות לסובב את צינור תערובת מאסטר כדי להבטיח תערובת הומוגנית.

סמן סט של צינורות PCR, הקפד לכלול פקדים. Aliquot נפח שווה של תערובת האב לתוך כל צינור. לאחר מכן, הוסף רכיבים ספציפיים לתגובה, כגון תמציות RNA או מים לשליטה שלילית.

לאחר הוספת כל הרכיבים, הנח את הצינורות בתרמוסקלר והגדר את תוכנית התמלול ההפוכה לפעול. לאחר מכן ניתן יהיה לחשוף את ה- cDNA להגברת PCR. לקבלת תיאור מפורט של שלב זה, עיין בסרטון הווידאו של אוסף זה ב- PCR.

כאשר ה- PCR הושלם, ניתן להפריד ולדמיין חלק ממוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז. לדוגמה, פריימר ספציפי לגנים שימש כאן כדי לזהות נוכחות של וירוס RNA. רצועות בגודל הצפוי מתקבלות מתגובת RT-PCR אך לא מהבקרות השליליות, המציינות את נוכחותו של וירוס זה בדגימת המים הנבדקת.

זיהוי מיקרואורגניזמים מבוססי RNA על ידי RT-PCR מאפשר ניתוח של בריאות אקולוגית, סיכונים סביבתיים ושימור המגוון הביולוגי.

השימוש במיקרואורגניזמים לניקוי פחמימנים וממסים מאדמה ומים מזוהמים מהווה חלופת תיקון ברת קיימא לסביבה. הבנת ביטוי גנים מיקרוביאליים מקוריים יכולה להדגיש מסלולים מיקרוביאליים ספציפיים שמפרקים מזהמים בתנאים אלה. RT-PCR מנוצל לעתים קרובות כדי להגביר mRNA מדגימות סביבתיות כאלה.

אמצעי בריאות הציבור דורשים לעתים קרובות מעקב מהיר אחר מקורות ויראליים של זיהום בסביבה. שפעת העופות, למשל, מדבקת מאוד ויכולה להתפשט במהירות לעופות, לבעלי חיים ואפילו לבני אדם. בדוגמה הספציפית הזו, החוקרים חיפשו את האיום של שפעת העופות המופצת על ידי ציפורי בר.

באמצעות התקנה ומנגנון RT-PCR ניידים, הם הקרינו מגוון של ציפורי בר, אפילו באזורים מרוחקים, כדי לזהות זיהומים מוקדם ולמנוע שידור.

לבסוף, RT-PCR יכול לשמש כדי לאפיין "biopesticides" שפותחו כדי למקד מזיקים כגון צלף זכוכית כנף, Homalodisca vitripennis, המארח למחלה שפוגע קשות גפנים בצפון אמריקה. נגיף RNA חד-גדילי חדש מפותח כסוכן להדביק את החרק הזה. באמצעות שילוב של תרבית התא Homalodisca ואישור RT-PCR של עומס ויראלי, מחברים אלה הצליחו להפיץ ריכוז גבוה של וירוס לשימוש כסוכן בקרה ביולוגית.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לניתוח אורגניזמים סביבתיים מבוססי RNA על ידי RT-PCR. עכשיו אתה צריך להבין את התיאוריה מאחורי הפרוטוקול, איך ליישם את הטכניקה למחקר שלך, וכמה דרכים שבהן הוא נמצא בשימוש בתחום היום. תודה שצפיתם!