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RNA-Analyse von Umweltproben mittels RT-PCR

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Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion oder RT-PCR, ermöglicht die Erkennung von RNA-Viren und Mikroben Genexpression in der Umgebung.

Im Gegensatz zu zellulären Organismen von den Menschen, Bakterien, die DNA als ihr genetisches Material zu verwenden, haben einige Viren Genome von RNS, einschließlich viele pathogene Viren wie Grippe, Ebola und HIV gemacht. Während einige Viren entdeckt werden können, durch die Beobachtung des pathogenen Phänotyps, der entsteht, wenn Zellen in Zellkultur infizieren verwendet, hat eine Mehrheit keine kulturbasierte Charakterisierungsmethoden. RT-PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein dieser Viren in der Umwelt mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen.

Zur gleichen Zeit express"" Organismen mit DNA-basierte Genome die genetische Information in ihrem DNA-Genom kodiert, indem "Transkription" in Messenger oder "m" RNA, die dann "in Proteine enzymatische oder strukturelle Aufgabe in Zellen übersetzt werden kann". Wie Mikroben reagieren und zur Anpassung an Veränderungen in der Umwelt durch ein- oder Ausschalten der verschiedenen genetischen Wege, kann RT-PCR verwendet werden, um solche Veränderungen in der Genexpression als potenzielle Ökosystem Assessoren dienen zu überwachen.

Dieses Video geht über die Grundsätze der RT-PCR eine verallgemeinerte Verfahren um diese Technik zu skizzieren, und schließlich betrachten wir einige der Möglichkeiten, die diese Methode in der Umweltmikrobiologie heute angewendet wird.

Es gibt zwei wichtige Teile zu diesem Verfahren: die Gewinnung von RNA aus biologischen Proben, gefolgt von der reversen Transkription in DNA.

Die Isolation der RNA beinhaltet lyse der Zellen in der Probe durch Zugabe von Waschmittel, die Lipide und Proteine, gefolgt von mechanischen Störungen abbaut. Gewinnung von RNA aus Viren in der Regel erfordert die Zugabe von Proteinasen, die Protein zu verdauen sind Enzyme zum Abbau der Viren Capsids - die harte Protein-Mäntel, die die Viruspartikel zu bilden. Auf der anderen Seite kann bei der RNA aus zellulären Organismen zu erhalten, die lysate mit DNA-abbauenden Enzymen oder DNAases nachgeschalteten Ergebnisse wird durch die Anwesenheit von chemisch ähnlichen DNA verwechselt zu vermeiden behandelt werden müssen.

RNA kann dann von Lysaten in zwei Arten gereinigt werden. In einer Methode, bekannt als Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion wird die lysate mit einer Bio-wässrige Mischung gemischt, die dann zentrifugiert, um die Phasen trennen. Proteine werden in die organische Phase lysierten Zellenrückstand in den bewölkten Interphase und Nukleinsäuren in der wässrigen Phase unterteilt werden. Die oberen wässrige Phase kann dann abgeholt werden, und RNA wird durch den Zusatz von Alkohol wie Isopropanol, das verringert die Nukleinsäure Löslichkeit in Wasser ausgefällt.

Spaltenbasierten RNA isoliert ist die lysate mit Alkohol vermischt und dann durch ein Gel-Filtration-Spalte mit einem negativ geladenen Harz, wie Kieselsäure. Die lysate ist vorbereitet, so dass positiv geladene Ionen in Puffer Form "Salz Brücken", die das negativ geladene Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren binden an das Harz erlauben. Andere Verunreinigungen sind dann weggespült. Nukleinsäuren sind aus der Spalte mit einer salzarmen Puffer oder Wasser "eluiert". Da einsträngige RNA weniger negative Ladungen als doppelsträngige DNA hat, kann es bevorzugt mit Puffern von bestimmten Konzentrationen eluiert werden.

Einmal isoliert, chemisch stabilen DNA RNA verwandelt. Wissenschaftler haben ein Enzym, das natürlich von Retroviren, wie HIV kodiert genutzt. Dieses Enzym wird als Reverse Transkriptase oder "RT" bezeichnet.

RT synthetisiert ergänzende oder "C" DNA aus einem kurzen Stück von Nukleotiden bekannt als Grundierung. Diese Grundierung kann verschiedene Sequenzen, je nach Zweck des Experiments haben. Beispielsweise kann die Grundierung gestaltet werden, eine bestimmte Reihenfolge haben, um bestimmte Gene oder Organismen zu erkennen. Sobald synthetisiert, kann dieses "ersten Strang" cDNA durch regelmäßige PCR verstärkt werden.

Jetzt haben wir ein Verständnis der Prinzipien hinter RT-PCR, ein Protokoll für die Durchführung dieser Technik auf RNA-Proben aus der Umgebung betrachten.

Um den Vorgang zu starten, finden Sie ein Beispiel Abholort mit GPS-Koordinaten oder aus den Augen. Wählen Sie zufällige Punkte innerhalb eines Bereichs um einen allgemeinen Überblick über mikrobielle Habitate zu erhalten.

Um die festen Probe sammeln, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden-Boden auf die vorgegebene Tiefe. Wenn die Schnecke aufgehoben wird, findet man Boden innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke.

Dieser Boden ist direkt in einen Auffangbeutel Boden gekratzt und die Tasche ist beschriftet mit Standort, Name, Datum, Zeit der Sammlung und alle weiteren notwendigen Informationen.

Den Boden im Labor zu übertragen und ein 2-mm-Sieb, Kies und Fels zu entfernen den Boden durchlaufen. Analysieren Sie eine Probe des Bodens für den Feuchtigkeitsgehalt, die informativ über das Niveau der mikrobiellen Aktivität im Boden sein kann. Um dies zu tun, finden Sie diese Sammlung video "Bestimmung der Feuchtigkeit Content of Soil".

Wählen Sie für Wasser-Musterkollektion einen Ort von Interesse, die ähnlich wie Boden-Sammlung, und sammeln Sie Wasser in eine sterile dickwandigen Plastikflasche. Achten Sie auf das Volumen des Wassers gesammelt. Test das Wasser sofort für Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzgehalt, die wichtige über erwartete mikrobielle Niveau in der Probe Informationen. Dann stellen Sie die Flasche in den Kühler und Transfer ins Labor.

Mikroorganismen wie Viren werden gesammelt und von der Umwelt Probe konzentriert.

RNA kann aus den gesammelten Viren durch die Spin-Spalte-Methode mit kommerziellen RNA-Extraktion-Kits nach Anweisungen des Herstellers extrahiert werden. Lyse Puffer, ergänzt mit Ethanol, ist zunächst mit der Probe gemischt. Legen Sie die entsprechende Anzahl an Spalten Spin in Röhrchen, dann gelten Sie die Proben auf die Spalte Matrix. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g für 1 – 2 min., die Nukleinsäuren binden an die Spalte, und die Flüssigkeit durchströmten entsorgen zu lassen.

Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren. Legen Sie die Spalten in neue, sterile 1,5 mL geringe Haftung Microfuge Röhren. Fügen Sie Wasser, das frei von RNases, sind Enzyme, die RNA, zu Spalten und Zentrifuge für 30 abgebaut s, um die RNA zu eluieren. Die eluierten RNA kann bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.

Vor dem Experiment sollte entsprechende Primer entworfen werden, um die Sequenzen von Interesse, zu erkennen, die als Marker für das Vorhandensein von bestimmten Mikroorganismen dienen kann.

Nehmen Sie die RT-Reagenzien bei-20 ° C gelagert und tauen Sie die gefrorenen Reagenzien auf Eis (oder bei Raumtemperatur). Dazu gehören Nukleotide, reverse Transkription Puffer und Grundierungen. Einmal aufgetaut, halten Sie die Reagenzien auf Eis; das Enzym Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor sollte immer auf Eis gehalten werden.

Während die Reagenzien Auftauen sind, berechnen der Mengen und Konzentrationen der Komponenten der Reaktion. Sobald die Reagenzien aufgetaut sind, sanft Wirbel und Spin jedes Rohr um den Inhalt zu gewährleisten sind gut gemischt.

Arbeiten in einem Laminar-Flow-Abzug auf Kontamination zu vermeiden, montieren Sie die Komponenten in einer master-Mix hinzufügen zu jedem PCR-Röhrchen. Bei der Montage der master-Mix in ein Eppendorf-Röhrchen unbedingt ändern Pipettenspitzen zwischen jedes Reagens um Kontaminationen zu vermeiden. Nachdem alle Reagenzien zu Eppendorf Tube hinzugekommen sind, mischen vorsichtig Vortex und Spin-down der Meister Röhre um eine homogene Mischung zu gewährleisten.

Beschriften Sie eine Reihe von PCR-Röhrchen, und achten Sie auf Steuerelemente enthalten. Aliquoten ein gleiches Volumen an den master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte oder Wasser für die negativ-Kontrolle.

Sobald alle Komponenten hinzugefügt werden, legen Sie die Rohre in einem Thermocycler und reversen Transkription auszuführenden Programms eingestellt. Die cDNA kann dann PCR Verstärkung unterworfen werden. Eine ausführliche Beschreibung dieses Schrittes finden Sie in dieser Sammlung Video-on-PCR.

Wenn die PCR abgeschlossen ist, können einige das PCR-Produkt getrennt und auf ein Agarosegel visualisiert. Zum Beispiel diente eine Gen-spezifische Primer hier auf das Vorhandensein eines RNA-Virus zu erkennen. Bands die erwartete Größe ergeben sich aus der RT-PCR-Reaktion aber nicht aus den Negativkontrollen, auf das Vorhandensein des Virus in der Wasserprobe getestet.

Die Identifizierung von RNA-basierten Mikroorganismen mittels RT-PCR ermöglicht Analyse der ökologischen Gesundheit, Risiken für die Umwelt und die Erhaltung der Biodiversität.

Die Verwendung von Mikroorganismen zu bereinigen, Kohlenwasserstoffe und Lösungsmittel aus verschmutzten Boden und Wasser stellt eine umweltfreundliches Sanierung Alternative dar. Native mikrobielle Genexpression zu verstehen kann spezifische mikrobielle Wege hervorheben, die Verunreinigungen unter diesen Bedingungen brechen. RT-PCR wird oft genutzt, um mRNA aus solchen Umweltproben zu verstärken.

Gesundheitspolitische Maßnahmen erfordern oft schnelle Überwachung der viralen Quellen der Infektion in der Umgebung. Vogelgrippe, beispielsweise ist hoch ansteckend und kann sich schnell ausbreiten, Geflügel, Vieh und sogar Menschen. In diesem speziellen Beispiel suchten Forscher die Gefahr der Vogelgrippe durch Wildvögel zu verbreiten.

Mit einem tragbaren RT-PCR Setup und Apparat, untersucht sie eine Reihe von Wildvögeln, auch in abgelegenen Gegenden, um Infektionen frühzeitig zu erkennen und verhindern die Übertragung.

Zu guter Letzt kann RT-PCR verwendet werden, zu charakterisieren "Biopestizide" entwickelt Ziel Schädlinge wie die glasig-winged Sharpshooter, Homalodisca Vitripennis, des Hosts für eine Krankheit, die Weinreben in Nordamerika stark schädigt. Ein neuartiger einsträngige RNA-Virus wird als Vermittler, dieses Insekt zu infizieren entwickelt. Mit einer Kombination der Homalodisca Zellkultur und RT-PCR-Bestätigung der Viruslast, konnten diese Autoren eine hohe Konzentration des Virus für den Einsatz als eine biologische Schädlingsbekämpfungsmittel zu propagieren.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Analyzing RNA-Based Umweltorganismen durch RT-PCR. Sie sollten jetzt die Theorie hinter dem Protokoll verstehen wie man die Technik für Ihre Forschung, und einige der Möglichkeiten, in denen es im Bereich heute dient, gelten. Danke fürs Zuschauen!

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