RT-PCR을 사용한 환경 검체의 RNA 분석

역전사 폴리머라제 연쇄 반응 또는 RT-PCR은 환경에서 RNA 바이러스 및 미생물 유전자 발현의 검출을 가능하게 한다.

인간에서 박테리아에 세포 유기체와는 달리, 그들의 유전 물질로 DNA를 사용 하 여, 일부 바이러스는 RNA로 만든 게놈, 독감 등 많은 병원성 바이러스를 포함 하 여, 에볼라, 그리고 HIV. 일부 바이러스는 세포 배양에서 세포를 감염시키는 데 사용될 때 발생하는 병원성 표현형을 관찰함으로써 검출될 수 있지만, 대다수는 배양 기반 특성화 방법이없다. RT-PCR은 고감도를 가진 환경에서 이러한 바이러스의 존재를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

동시에 DNA 기반 게놈을 가진 유기체는 DNA 게놈에 인코딩된 유전 정보를 메신저 또는 "m"RNA로 "전사"하여 "표현"한 다음 세포에서 효소 또는 구조적 기능을 수행하기 위해 단백질로 "변환"될 수 있습니다. 미생물이 다양한 유전 적 경로를 켜거나 끄면 환경의 변화에 반응하고 적응함에 따라 RT-PCR을 사용하여 잠재적 인 생태계 평가자로 봉사하기 위해 유전자 발현의 이러한 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

이 비디오는 RT-PCR뒤에 있는 원리를 통해 갈 것입니다, 이 기술을 능력을 발휘하기 위하여 일반화된 절차를 설명하고, 마지막으로, 이 방법이 오늘 환경 미생물학에서 적용되고 있는 방법의 몇몇을 검토합니다.

이 절차에는 두 가지 핵심 부분이 있습니다: 생물학적 샘플에서 RNA를 추출한 다음 DNA로의 역전사가 뒤따릅니다.

RNA의 격리는 지질과 단백질을 분해하는 세제를 추가하여 샘플에 있는 세포를 리징하고 기계적 중단을 포함합니다. 바이러스에서 RNA를 추출하는 것은 일반적으로 바이러스의 capsids - 바이러스 입자를 형성하는 힘든 단백질 코트를 분해하기 위해 단백질 소화 효소인 단백질효소를 첨가해야 합니다. 한편, 세포 유기체로부터 RNA를 얻을 때, 리스는 화학적으로 유사한 DNA의 존재에 의해 혼동되는 다운스트림 결과를 피하기 위해 DNA 분해 효소, 또는 DNAases로 취급될 필요가 있을 수 있습니다.

RNA는 그 때 두 가지 방법 중 하나에 있는 lysates에서 정제될 수 있습니다. 산과니디늄 티오시네이트-페놀 클로로폼 추출로 알려진 한 가지 방법에서, 리자테는 그 후 원심분리된 유기 수성 혼합물과 혼합되어 위상을 분리한다. 단백질은 유기 상으로 분할되고, 흐린 중간 단계로 세포 이물질을, 핵산은 수성 상으로 분할됩니다. 상부 수성 상은 그 때 수집될 수 있고, RNA는 물에 있는 핵산의 용해도를 감소시키는 이소프로판올과 같은 알콜의 첨가에 의해 침전됩니다.

컬럼 계 RNA 절연에서, 용액은 알코올과 혼합된 다음 실리카와 같은 음전하 수지와 함께 젤 여과 컬럼을 통과한다. 용액은 핵산의 음전하 인산염 중추가 수지에 결합할 수 있도록 완충 형태로 양전하 이온이 "소금 다리"되도록 준비됩니다. 다른 모든 오염 물질은 씻어. 핵산은 저염 완충제 또는 물을 사용하여 컬럼에서 "용출"됩니다. 단일 좌초 RNA는 이중 좌초 된 DNA보다 음전하가 적기 때문에 특정 농도의 완충액을 사용하여 우선적으로 용출 될 수 있습니다.

일단 고립되면, RNA는 더 화학적으로 안정된 DNA로 변환됩니다. 과학자들은 HIV와 같은 레트로 바이러스에 의해 자연적으로 인코딩 된 효소를 활용했습니다. 이 효소는 역 전사, 또는 "RT"로 알려져 있습니다.

RT는 프라이머로 알려진 뉴클레오티드의 짧은 스트레칭에서 보완 또는 "c"DNA를 합성합니다. 이 프라이머는 실험의 목적에 따라 다른 시퀀스를 가질 수 있습니다. 예를 들어, 프라이머는 특정 유전자 또는 유기체를 검출하기 위해 특정 서열을 갖도록 설계될 수 있다. 일단 합성되면, 이 "첫 번째 가닥" cDNA는 일반 PCR에 의해 증폭될 수 있습니다.

이제 RT-PCR의 원리에 대한 이해를 갖게 되었으므로 환경에서 수집된 RNA 샘플에서 이 기술을 수행하기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면 GPS 좌표 또는 시력을 사용하여 샘플 수집 위치를 찾습니다. 지역 내에서 무작위 점을 선택하여 미생물 서식지에 대한 일반적인 조사를 받으십시오.

고체 샘플을 수집하려면 손 오거를 접지 토양으로 밀어 넣고 소정의 깊이로 비틀어보세요. 오거를 들어 올릴 때, 토양은 오거의 중공 줄기 내에서 찾을 수 있습니다.

이 토양은 토양 수집 가방에 직접 긁어 내고 가방은 위치, 이름, 날짜, 수집 시간 및 기타 필요한 정보로 표시되어 있습니다.

토양을 실험실로 옮기고 2mm 체를 통과하여 자갈과 바위를 제거합니다. 토양내 미생물 활성 수준에 대해 유익할 수 있는 수분 함량을 위해 토양샘플을 분석한다. 이렇게 하려면 이 컬렉션의 동영상 "토양의 수분 함량 측정"을 참조하십시오.

물 샘플 수집의 경우 토양 수집과 유사한 관심 있는 장소를 선택하고 물을 멸균 두꺼운 벽으로 된 플라스틱 병에 수집합니다. 수집된 물의 양을 기록하십시오. 온도, pH 및 염분과 같은 매개 변수에 대해 즉시 물을 테스트하여 샘플에서 예상되는 미생물 수준에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그런 다음 병을 쿨러에 넣고 실험실로 옮습니다.

바이러스와 같은 미생물은 환경 샘플로부터 수집 및 농축된다.

RNA는 제조업체의 지시에 따라 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 스핀 컬럼 방법에 의해 수집된 바이러스로부터 추출될 수 있다. 에탄올로 보충된 리시스 버퍼는 먼저 샘플과 혼합됩니다. 적절한 스핀 컬럼 수를 수집 튜브에 넣은 다음 샘플을 컬럼 행렬에 적용합니다. 핵산이 컬럼에 결합하고 액체 흐름을 폐기할 수 있도록 1-2 분 동안 약 12,000 x g의 컬럼을 원심 분리합니다.

열과 원심분리기에 버퍼를 다시 추가합니다. 컬럼을 새로운 멸균 1.5mL 저유착 마이크로퍼지 튜브에 넣습니다. 그런 다음 RNA를 저하시키는 효소인 RNases가 없는 물을 30초 동안 컬럼과 원심분리기에 추가하여 RNA를 엘로우시합니다. 용출된 RNA는 사용 전까지 -80°C로 저장할 수 있다.

실험 전에, 적절한 프라이머는 특정 미생물의 존재에 대한 마커 역할을 할 수있는 관심의 순서를 감지하기 위해 설계되어야한다.

-20°C에 저장된 RT 시약을 꺼내 얼음(또는 실온)에 냉동 시약을 해동합니다. 이들은 뉴클레오티드, 역전사 완충제 및 프라이머를 포함한다. 해동되면 시약을 얼음 위에 두십시오. 역전사 효소및 RNase 억제제는 항상 얼음 위에 보관되어야 합니다.

시약이 해동하는 동안 반응의 구성 요소의 부량과 농도를 계산합니다. 시약이 해동되면 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 내용이 잘 섞이도록 합니다.

오염을 방지하기 위해 라미나르 플로우 후드에서 작업하여 마스터 믹스에 구성 요소를 조립하여 각 PCR 튜브에 추가합니다. Eppendorf 튜브에서 마스터 믹스를 조립할 때 각 시약 사이에 파이펫 팁을 변경하여 오염을 방지해야 합니다. 모든 시약이 Eppendorf 튜브에 추가 된 후, 부드럽게 소용돌이와 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 마스터 믹스 튜브아래로 회전.

PCR 튜브 세트에 레이블을 지정하여 컨트롤을 포함해야 합니다. 각 튜브에 마스터 믹스의 동일한 볼륨을 알리쿼트. 이어서, RNA 추출물 또는 물과 같은 반응 특이적 성분을 추가하여 음의 대조를 이에 부릅니다.

모든 구성 요소가 추가되면 튜브를 열순환에 배치하고 역전사 프로그램을 실행하도록 설정합니다. 그 때 cDNA는 PCR 증폭을 실시할 수 있다. 이 단계에 대한 자세한 설명은 PCR에서 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

PCR이 완료되면 일부 PCR 제품을 아가로즈 젤에 분리하고 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 특이적 프라이머는 RNA 바이러스의 존재를 검출하기 위해 여기에서 사용되었다. 예상 된 크기의 밴드는 RT-PCR 반응에서 얻을 수 있지만 음의 대조군에서, 테스트되는 물 샘플에서이 바이러스의 존재를 나타내는.

RT-PCR에 의한 RNA 기반 미생물의 식별은 생태 건강, 환경 위험 및 생물 다양성의 보존에 대한 분석을 가능하게 합니다.

오염된 토양과 물에서 탄화수소와 용매를 정화하기 위해 미생물을 사용하는 것은 생태학적 개선 대안을 나타냅니다. 네이티브 미생물 유전자 발현을 이해하면 이러한 조건 하에서 오염 물질을 분해하는 특정 미생물 경로를 강조 할 수 있습니다. RT-PCR은 종종 이러한 환경 샘플에서 mRNA를 증폭하는 데 활용됩니다.

공중 위생 측정은 수시로 환경에 있는 감염의 바이러스성 근원의 급속한 감시를 요구합니다. 예를 들어, 조류 인플루엔자는 전염성이 매우 높으며 가금류, 가축, 심지어 인간까지 빠르게 퍼질 수 있습니다. 이 특별한 예에서, 연구원은 야생 조류에 의해 퍼진 조류 인플루엔자의 위협을 찾아냈습니다.

휴대용 RT-PCR 설정 및 장치를 사용하여, 그들은 조기에 감염을 감지하고 전송을 방지하기 위해, 심지어 원격 지역에서 야생 조류의 범위를 선별.

마지막으로 RT-PCR은 북미의 포도나무를 심각하게 손상시키는 질병의 호스트인 유리 날개 날카로운 사수, 호팔로디스카 비트리페스타 와 같은 해충을 대상으로 개발중인 "생체 살충제"를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 곤충을 감염시키기 위한 에이전트로서 새로운 단일 좌초 RNA 바이러스가 개발되고 있습니다. 호발로디스크 세포 배양과 바이러스 부하의 RT-PCR 확인의 조합을 사용하여, 이 저자는 생물학적 통제제로 사용하기 위하여 바이러스의 고농도를 전파할 수 있었습니다.

RT-PCR에 의한 RNA 기반 환경 유기체 분석에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 프로토콜의 이론, 연구에 기술을 적용하는 방법 및 오늘날 현장에서 사용되는 몇 가지 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!