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Análisis de muestras ambientales mediante RT-PCR del ARN
 

Análisis de muestras ambientales mediante RT-PCR del ARN

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Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, o RT-PCR permite la detección de los virus ARN y genes microbianos en el medio ambiente.

A diferencia de organismos celulares de los seres humanos a las bacterias, que utilizan el ADN como su material genético, algunos virus tienen genomas de ARN, incluyendo muchos patógenos virus como la gripe, el Ebola y el VIH. Mientras que algunos virus pueden ser detectadas observando el fenotipo patógeno que se desarrolla cuando se utiliza para infectar células en cultivo celular, una mayoría no tiene ningún método de caracterización basada en la cultura. RT-PCR puede utilizarse para detectar la presencia de estos virus en el ambiente con alta sensibilidad.

Al mismo tiempo, organismos con genomas de DNA-basados "expresan" la información genética codificada en su genoma de ADN por "transcribir" en messenger o "m" RNA, que puede entonces ser "traducido" proteínas para realizar función estructural o enzimática en las células. Microbios responderán y adaptan a los cambios en el ambiente por dar vuelta encendido o apagado de diferentes vías genéticas, RT-PCR puede utilizarse para supervisar tales alteraciones en la expresión génica para servir como potenciales evaluadores de ecosistema.

Este vídeo pasará sobre los principios detrás de RT-PCR, detallar un procedimiento generalizado para realizar esta técnica y por último, examinar algunas de las formas de que este método se aplica en Microbiología Ambiental hoy.

Hay dos partes fundamentales de este procedimiento: la extracción de RNA de muestras biológicas, seguido de su transcripción inversa en el ADN.

El aislamiento de ARN consiste en lisis de las células en la muestra mediante la adición de un detergente que descompone los lípidos y proteínas, seguidas por la interrupción mecánica. Extracción de RNA de virus generalmente requiere la adición de proteinasas, que son los que digieren la proteína enzimas para romper la cápsida de los virus - las capas de proteína dura que forman la partícula viral. Por otro lado, cuando obtener RNA en organismos celulares, lisado puede necesitar ser tratados con enzimas degradadoras de ADN, o DNAases, para evitar resultados abajo están confundidos por la presencia de la DNA químicamente similar.

RNA se puede entonces purificar de lisados de dos maneras. En un método conocido como extracción de ácido Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo, lisado se mezcla con una mezcla orgánica acuosa que luego se centrifuga para separar las fases. Las proteínas se reparten en la fase orgánica, restos de células sometidas a lisis en la interfase nublada y los ácidos nucleicos en la fase acuosa. Entonces se puede recoger la fase acuosa superior y RNA se precipita por adición de alcohol como isopropanol, que disminuye la solubilidad del ácido nucleico en el agua.

En aislamiento de RNA base de columna, el lisado se mezcla con alcohol y luego pasa a través de una columna de gel filtración con una resina cargada negativamente, tales como sílice. El lisado es preparado para que los iones cargados positivamente en la forma de tampón "puentes de sal" que permiten a la espina dorsal del fosfato cargado negativamente de los ácidos nucleicos para enlazar a la resina. Otros contaminantes son luego arrastrados. Los ácidos nucleicos son "eluidos" de la columna usando un tampón de baja en sal o agua. RNA monocatenario tiene menos cargas negativas que el ADN de doble hebra, se puede ser preferentemente eluyó utilizando búferes de concentraciones específicas.

Una vez aislado, el ARN se transforma en el ADN más químicamente estable. Los científicos han utilizado una enzima natural codificada por retrovirus como el VIH. Esta enzima es conocida como transcriptasa inversa, o "RT".

RT sintetiza el ADN complementario o "c" de un tramo corto de nucleótidos conocido como imprimación. Esta cartilla puede tener diferentes secuencias, dependiendo de la finalidad del experimento. Por ejemplo, la cartilla puede diseñarse para tener una secuencia específica, para la detección de genes específicos o los organismos. Una vez sintetizado, este cDNA "primera cadena" puede se amplifica por PCR regular.

Ahora que tenemos una comprensión de los principios detrás de RT-PCR, echemos un vistazo a un protocolo para la realización de esta técnica en RNA de muestras recogidas del ambiente.

Para comenzar el procedimiento, encontrar un punto de recogida de muestra mediante coordenadas GPS o la vista. Seleccione puntos al azar dentro de un área para obtener un estudio general de los hábitats microbianos.

Para recolectar la muestra sólida, empuje y gire un taladro de mano en el suelo de tierra a la profundidad predeterminada. Al levanta la barrena, suelo puede encontrarse en el tallo hueco de la barrena.

Este suelo es raspado directamente en un bolso de la colección de suelo y la bolsa está etiquetada con la ubicación, nombre, fecha, hora de recolección y cualquier otra información necesaria.

Transferencia de la tierra al laboratorio y pasar el suelo a través de un tamiz de 2 mm para extraer grava y roca. Analizar una muestra de suelo para contenido de humedad, que puede ser informativo sobre el nivel de actividad microbiana en el suelo. Para hacer esto, consulte video "determinación de humedad contenido de suelo" de esta colección.

Para recolección de muestras de agua, elegir un sitio de interés similar a la colección de suelo y recoger el agua en una botella de plástico estéril pared gruesa. Tome nota del volumen de agua recolectada. Prueba el agua inmediatamente para parámetros como temperatura, pH y salinidad, que puede proporcionar información importante acerca de los niveles microbianos esperados en la muestra. Luego, coloque la botella en el refrigerador y traslado al laboratorio.

Microorganismos como los virus son recogidos y concentrados de la muestra ambiental.

RNA se puede extraer de los virus recogidos por el método de columna de vuelta usando kits comerciales de extracción de RNA según instrucciones del fabricante. Tampón de lisis, con etanol, se mezcla primero con la muestra. Coloque el número apropiado de columnas spin en tubos, luego aplicar las muestras en la matriz de la columna. Las columnas de aproximadamente 12.000 x g durante 1-2 min dejar que los ácidos nucleicos se unen a la columna y deseche el líquido flujo a través de centrífuga.

Añadir tampón de lavado a las columnas y centrifugue de nuevo. Colocar las columnas en los tubos del microfuge nueva y estéril 1,5 mL baja de la adherencia. A continuación, añadir agua libre de RNasas, que son enzimas que degradan RNA, para las columnas y centrifugue durante 30 s a fin de eluir el RNA. El ARN eluído puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso.

Antes del experimento, adecuados primers deben estar diseñados con el fin de detectar las secuencias de interés, que pueden servir como marcadores para la presencia de microorganismos específicos.

Sacar los reactivos de RT almacenados a-20 ° C y descongelar los reactivos congelados en el hielo (o a temperatura ambiente). Estos incluyen nucleótidos, buffer de transcripción reversa y cartillas. Una vez descongelado, mantener los reactivos en el hielo; la enzima transcriptasa reversa y el inhibidor de la Rnasa siempre debe mantenerse en hielo.

Mientras que los reactivos están deshelando, calcular los volúmenes y concentraciones de los componentes de la reacción. Una vez que los reactivos son descongelados, suavemente vortex y vuelta cada tubo para asegurar el contenido estén bien mezclados.

Trabajar en campana de flujo laminar para evitar la contaminación, ensamblar los componentes en una mezcla maestra para agregar a cada tubo PCR. Al montar la mezcla principal en un tubo Eppendorf, asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre cada reactivo para evitar la contaminación. Después de todos los reactivos se han añadido al tubo Eppendorf, vortex y giro el maestro mezclan suavemente el tubo para asegurar una mezcla homogénea.

Etiquetar un conjunto de tubos PCR, asegurándose de incluir controles. Parte alícuota de un volumen igual de la mezcla principal en cada tubo. Luego, añadir componentes de reacción específica, como el agua para el control negativo o extractos de RNA.

Una vez que se agregan todos los componentes, coloque los tubos en un termociclador y establecer el programa de transcripción reversa para ejecutarse. El cDNA puede ser sometido luego a la amplificación por PCR. Para una descripción detallada de este paso, consulte el vídeo de la colección en la PCR.

Cuando se completa la polimerización en cadena, algunos de los productos PCR pueden ser separados y visualizados en un gel de agarosa. Por ejemplo, una cartilla gene-específica fue utilizada aquí para detectar la presencia de un virus de ARN. Bandas del tamaño esperado se obtienen de la reacción de RT-PCR pero no de los controles negativos, indicando la presencia de este virus en la muestra de agua poniendo a prueba.

La identificación de microorganismos basados en RNA por RT-PCR permite el análisis de riesgos ambientales, salud ecológica y la conservación de la biodiversidad.

El uso de microorganismos para limpiar hidrocarburos y disolventes de aguas y suelos contaminados representa una alternativa de remediación ecosostenible. Comprensión expresión genética microbiana nativa puede destacar vías microbianas específicas que descomponen contaminantes en estas condiciones. RT-PCR a menudo se utiliza para amplificar mRNA de tales muestras ambientales.

Medidas de salud pública a menudo requieren vigilancia rápida de fuentes virales de la infección en el medio ambiente. La gripe aviar, por ejemplo, es altamente contagioso y puede propagarse rápidamente y las aves de corral, ganado, incluso los seres humanos. En este ejemplo en concreto, los investigadores buscaron la amenaza de la gripe aviar transmitida por aves silvestres.

Utilizando una instalación portátil de RT-PCR y aparatos, proyectó una variedad de aves silvestres, incluso en áreas remotas, para detectar las infecciones temprano y prevenir la transmisión.

Por último, RT-PCR puede utilizarse para caracterizar "biopesticidas" desarrollados a parásitos de la blanco como la Chicharrita de alas cristalinas Homalodisca vitripennis, el propietario de una enfermedad que daña seriamente la vid en América del norte. Un nuevo virus de ARN monocatenario está siendo desarrollado como un agente para infectar a este insecto. Usando una combinación de cultivo celular de Homalodisca y confirmación de RT-PCR de la carga viral, estos autores fueron capaces de propagar una alta concentración de virus para su uso como un agente de control biológico.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a los organismos ambientales Analyzing RNA-Based por RT-PCR. Ahora debería entender la teoría detrás del Protocolo, cómo aplicar la técnica a su investigación y algunas de las formas en que se está utilizando en el campo hoy. ¡Gracias por ver!

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