Overview
출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠
조류는 하나의 일반적인 특성, 즉 광합성 안료의 소유를 갖는 미생물의 매우 이질적인 그룹입니다. 환경에서 조류는 물 속에서 성장하여 수영장 소유자에게 문제를 일으킬 수 있습니다. 조류는 또한 독소를 방출하는 조류 꽃으로 인해 호수와 저수지와 같은 지표수에 문제를 일으킬 수 있습니다. 최근에는 조류 바이오 연료를 통해 새로운 에너지원으로 평가되고 있습니다. 블루-그린 조류는 실제로 시아노 박테리아로 분류 하는 박테리아. 시아노박테리아뿐만 아니라 photoynthesize, 뿐만 아니라 대기에서 질소 가스를 해결할 수있는 능력을 가지고있다. 다른 조류는 해초와 같은 복잡한 다세포 유기체에 단세포 유기체에서 구역 수색하는 진핵증입니다. 여기에는 녹조류, 유글레노이드, 디노플라겔레이트, 황금갈색 조류, 규음, 갈색 조류 및 붉은 조류가 포함됩니다. 토양에서, 조류 인구는 자주 106 그램 당. 이 숫자는 박테리아, actinomycetes 및 곰팡이에 대한 해당 숫자보다 낮으며, 광합성에 필요한 햇빛이 토양 표면 아래에 멀리 침투 할 수 없기 때문입니다.
조류는 광영양이기 때문에 광합성과 이산화탄소로부터 에너지를 얻고 이산화탄소로부터 바이오매스를 위한 에너지를 얻기 때문에, 전적으로 무기 영양소와 유기 탄소 기질 없이 구성된 성장 매체에서 성장할 수 있다. 유기 기판의 부족은 이종성 균 박테리아의 성장을 배제. 무기 성장 배지를 사용하여, 원래 토양 또는 물에 존재하는 조류는 가장 가능한 수(MPN) 방법에 의해 양수될 수 있다. MPN 방법은 조류 자체가 멸종으로 희석되는 것을 연속적으로 희석하는 것에 의존합니다. 어떤 희석에 조류의 존재는 매체에 있는 성장의 긍정적인 표시에 의해 결정됩니다, 이는 전형적으로 광합성에서 유래하는 조류의 녹색 점액이다. 각 희석에서 복제 튜브를 사용하고 주어진 희석에서 성장을 위해 양성 튜브의 수의 통계적 평가를 통해 원래 샘플에 존재하는 조류의 수를 계산할 수 있습니다. MPN 테이블은 각 희석에 사용되는 복제 수를 포함하여 특정 MPN 디자인에 따라 개발 및 게시되었습니다.
Procedure
- 10g의 토양 샘플을 계량하여 현장에서 습한 채 수집되었거나 물을 첨가하여 2-3일 동안 촉촉하게 유지되도록 합니다. 토양은 촉촉하지만 포화되지 않아야합니다.
- 수정된 브리스톨용액의 95mL에 10g의 토양을 추가하여 10배 희석 계열을 준비한다(그림1). 수정 된 브리스톨의 용액을 만들려면, 물 1,000 mL에서 다음을 용해 : 0.25 g NaNO3,0.025 g CaCl2,0.075 g MgSO-4 · 7H2O, 0.075 g K2HPO4,0.018 g KH2PO4,0.025 g NaCl, 0.5 mg FeCl3.
- 브리스톨 솔루션의 서스펜션 A~ 9mL의 1mL와 추가 순차 희석을 추가하여 희석 계열을 계속합니다.
- 접종 5 복제 튜브 각각 9 mL의 수정 된 브리스톨용액1mL을 포함 10-2 ~ 10-6 (표 1).
- 햇빛에 노출된 지역에서 캡된 튜브를 최대 4주 동안 배양합니다.
- 7일에 한 번씩 조류 성장을 위한 튜브를 관찰하십시오. 조류 가 성장을 가진 튜브는 녹색으로 나타납니다.
그림 1. 10배 희석 시리즈를 만드는 방법.
| 관 | 희석 |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
표 1. 튜브와 희석.
조류는 다양한 환경에 사는 광합성 유기체입니다. 토양 주거 조류는 실험실에서 배양 될 수 있으며, 간단한 계산을 사용하여 열거 농도.
조류는 하나의 일반적인 특성, 즉 광합성 안료의 소유, 일반적으로 엽록소를 가지고 유기체의 매우 이질적인 그룹입니다. 조류의 대부분은 현미경, 그러나, 그룹의 정확한 정의는 논쟁의 여지가, 또한 해조류를 포함, 이는 일반적으로 거시적이다.
환경에서 조류는 호수나 저수지와 같은 지표수에 문제를 일으키고, 수분 영양분을 고갈시키는 조류 꽃을 형성하고, 수면을 넘어 지나가는 빛을 차단하고, 독소를 방출할 수 있다. 견본에 있는 조류를 열거하는 기능은 과학자가 생태계의 건강 및 조류 과성장의 잠재적인 리스크를 평가할 수 있습니다.
토양에 있는 조류 인구는 수시로 그램 당 약 1만 세포에서 생깁니다. 조류는 토양 표면 아래까지 침투 할 수없는 광합성에 대한 햇빛을 필요로하기 때문에 이러한 숫자는 일반적으로 박테리아, 곰팡이, 또는 actinomycetes의 해당 농도보다 낮다.
이 비디오는 실험실에서 토양에서 조류를 배양하는 방법과 시작 토양 샘플에서 조류의 농도를 예거하는 방법을 보여줍니다.
조류는 생태계에 유익한 영향을 미칩니다. 청록색 조류 또는 시아노박테리아는 대기중의 질소 가스를 고칠 수 있어 반건조한 환경에서 토양 질소를 증가시키고 바이오 연료 생산을 위한 잠재적 도구로도 유용하게 만듭니다.
다른 조류는 진핵증이며, 해초와 같은 복잡한 다세포 유기체에 단세포에서 다양합니다. 여기에는 녹조류, 유글레노이드, 디노플라겔레이트 및 규음, 갈색 조류 및 붉은 조류가 포함됩니다.
조류는 광합성및 이산화탄소로부터 바이오매스를 위한 탄소로부터 에너지를 얻는 광영양입니다. 그 결과, 유기 탄소 기질이 첨가되지 않고 무기 영양소로 구성된 미디어에서 재배할 수 있습니다. 유기 기판의이 부족은 성장을 위한 외부 유기 탄소에 의존하는 이종성 균박테리아의 성장을 방지합니다.
열거용 조류를 배양하기 위해 토양 시료는 mL당10-6g토양으로 10배 씩 연속적으로 희석되고 성장 배지에서 배양된다. 각 희석에 대해 여러 복제가 만들어집니다. 그(것)들은 그 때 조류 성장을 허용하기 위하여 4 주까지 잘 빛나는 지역에 있는 배양됩니다.
희석에 조류의 존재는 일반적으로 녹색 점액으로 나타납니다 매체에서 성장의 긍정적 인 표시에 의해 결정된다. 마지막으로, 조류 성장을 위해 설계된 경험적으로 개발된 MPN 테이블이 상담되어 사용자가 희석 복제의 성장에 따라 원래 의 조류 농도를 결정할 수 있게 된다. MPN 방법은 조류가 멸종으로 희석되는 것과 같은 시료의 직렬 희석에 의존하므로 일부 희석에서는 조류 성장이 계속되지 않습니다.
이제 우리는 샘플에서 조류를 재배하고 예포하는 개념에 익숙해졌기 때문에 실험실에서 이것이 어떻게 수행되는지 살펴 보겠습니다.
실험을 시작하기 위해, 먼저 10 그램의 습한 토양을 현장에서 습한 채 수거하거나 수분을 보충하고 2~3일 동안 촉촉하게 유지하였다. 토양은 포화되지 않아야하지만 포화되지 않아야합니다.
다음으로, 수정 된 브리스톨의 용액 또는 MBS의 95 mL에 토양 10 그램을 먼저 추가하여 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 이 레이블을 서스펜션 A로 레이블을 지정합니다.
격렬하게 흔들린 후, 시험관에 MBS의 서스펜션 A1mL ~ 9mL를 추가하여 희석 시리즈를 계속하십시오. 이 10배 희석 시리즈를 4회 더 계속하여 mL당 최대10-6g의 희석을 제공합니다.
다음으로, 5개의 복제 튜브를 접종하고, 각각10~10-5의 희석제 각각 1mL를 포함하는MBS9mL을 함유하고 있다. 이로 인해10-2에서 10-6까지 각 희석에대해 5개의 튜브가 복제됩니다. 튜브를 느슨하게 캡합니다.
마지막으로, 햇빛에 노출된 지역에서 4주 동안 튜브를 배양합니다. 7일에 한 번씩 조류 성장을 위한 튜브를 관찰하십시오. 조류 성장을 나타내는 튜브는 녹색으로 나타납니다.
대부분의 가능성 있는 숫자 또는 MPN, 분석은 집중된 초기 기판의 희석에서 성장한 미생물을 열거하기 위하여 일반적으로 이용되는 수학 방법입니다. 용액의 희석 계수와 각 희석에서 성장의 긍정적인 징후를 보이는 튜브의 수를 고려하여, 원래 토양 샘플의 그램당 가장 가능성이 높은 수의 유기체를 MPN 테이블과 간단한 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.
MPN을 계산하기 위해, 가장 많은 수의 양성 복제 튜브를 가진 가장 높은 희석은 p1의라벨을 할당하며, 이 경우 튜브 C의 복제. 대조적으로, D & E에서 튜브의 일부는 조류 성장의 흔적없이 부정적이다.
긍정적 인 성장을 보여주는 다음 두 개의 높은 희석에 튜브의 수는 p2와 p3로표시됩니다. 여기, p2 = D 및 p3 = E.
P1의 값은 MPN 테이블의 첫 번째 열을 내려다보면 찾을 수 있습니다. p2 열도 마찬가지입니다. 마지막으로, p3의값은, 상단에 걸쳐, p 1 및 p 2에의해 정의된 두 가지를 교차하는 데 사용되며, mL 당 가장 가능성이 높은 수의 유기체의 값을 제공합니다.
다음으로, 원래 토양 샘플에서 그램당 유기체의 농도를 계산하기 위해, 이 값은 p 2가 할당된 희석내토양의 농도로 나뉜다. 다음 방정식은 토양의 그램 당 유기체의 실제 수를 정의하는 데 사용됩니다.
Algal 열거 및 MPN 분석은 다양한 응용 프로그램을 가지고 있으며, 그 중 일부는 여기에서 탐구됩니다.
조류 열거의 이 배양 방법은 다양한 설정에서 사용할 수 있습니다. 그것은 조류 수준을 결정하기 위해 강이나 호수에 적용 할 수 있습니다, 유해한 조류 꽃의 위험을 평가. 또는 수영장, 분수 또는 기타 식수원을 포함하여 인간이 보다 직접적으로 사용하는 물의 청결과 안전을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 식수 샘플과 수영장에서, 조류가 존재하지 않습니다.
열거를 위한 MPN 분석은 또한 그밖 비 조류 미생물에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 수질은 대장균 또는 대장균과같은 지표 유기체를 사용하여 평가될 수 있다. 여기서, 샘플은 지표 유기체의 존재에서 색상 또는 형광을 생성하도록 변경되는 화학 물질을 포함하는 매체로 배양될 수 있다. 개별 세포에서 이 실험의 여러 개의 작은 복제를 수행함으로써, 공지된 농도로 희석된 시료와 함께, 양성 세포의 비율은 특정 지표 유기체에 대한 MPN 표에 참조될 수 있고, 결정된 시료의 시작 농도.
조류는 또한 상업적인 응용을 위해 배양될 수 있습니다. 예를 들어, 일부 유형의 바이오 비료는 식물과의 공생으로 작용할 수 있는 청록색 조류를 활용하여, 토양이 열악한 지역에서 작물 성장을 돕는 데 특히 유용합니다. 마찬가지로, 조류는 바이오 연료를 위해, 또는 가축에 대 한 영양이 풍부한 식품의 소스로 재배 될 수 있습니다.
당신은 조류 문화와 열거에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이제 조류 성장을 위해 토양 샘플을 희석하는 방법, 실험실에서 조류를 배양하는 방법 및 시작 샘플의 조류 농도를 확대하는 방법을 이해해야합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Results
도 2는 대표적인 결과의 예입니다.
p1은 양성 튜브수가 가장 많은 가장 높은 희석(토양에 집중된 최소)의 복제 튜브 수로 선택된다. 여기서 튜브 B의 복제는 튜브 C의 복제가 더 높은 희석에서 이기 때문에 계산되지 않습니다. 대조적으로, 성장의 긍정적인 표시를 보여주는 Tube D에서 튜브의 수는 튜브 C에서 그 보다는 적습니다. 그래서, p1 = 5.
p2 및 p3은 성장의 긍정적 인 징후를 보여주는 다음 두 개의 높은 희석에서 튜브의 수로 선택된다. 따라서 p2 = 3 및 p3 = 1.
p1의 값은 표 2의첫 번째 열을 내려다보면 찾을 수 있습니다. p2 열에서도 마찬가지입니다. 그런 다음 p3(위쪽)의 값은 p1 및 p2값에의해 정의된 두 값을 교차합니다. 이 예에서 값은 mL당 1.1 유기체입니다.
이 값을 p2를할당한 희석의 토양 농도로 나눈다. 이 예제에서는 튜브 D입니다.
따라서, 이 예에서는 토양의 g당 1.1 x 104 조류 세포가 있었다. 이 값은 토양에서 발견되는 조류 의 수의 상당히 전형적이다.
그림 2. 조류 열거 실험의 가설 결과. 그늘진 튜브는 조류의 존재를 나타냅니다. 그늘이 없는 튜브는 조류의 부재를 나타냅니다.
| p3의 표시된 값에 대한 가장 가능성이 높은 수 | |||||||
| p1 | p2 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0 0 0 0 0 0 |
0 1 2 3 4 5 |
-- 0.018 0.037 0.056 0.075 0.094 |
0.018 0.036 0.055 0.074 0.094 0.11 |
0.036 0.055 0.074 0.093 0.11 0.13 |
0.054 0.073 0.092 0.11 0.13 0.15 |
0.072 0.091 0.11 0.13 0.15 0.17 |
0.090 0.11 0.13 0.15 0.17 0.19 |
| 1 1 1 1 1 1 |
0 1 2 3 4 5 |
0.020 0.040 0.061 0.083 0.11 0.13 |
0.040 0.061 0.082 0.1 0.13 0.16 |
0.060 0.081 0.10 0.13 0.15 0.17 |
0.080 0.10 0.12 0.15 0.17 0.19 |
0.10 0.12 0.15 0.17 0.19 0.22 |
0.12 0.14 0.17 0.19 0.22 0.24 |
| 2 2 2 2 2 2 |
0 1 2 3 4 5 |
0.045 0.068 0.093 0.12 0.15 0.17 |
0.068 0.092 0.12 0.14 0.17 0.20 |
0.091 0.12 0.14 0.17 0.20 0.23 |
0.12 0.14 0.17 0.20 0.23 0.26 |
0.14 0.17 0.19 0.22 0.25 0.29 |
0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.32 |
| 3 3 3 3 3 3 |
0 1 2 3 4 5 |
0.078 0.11 0.14 0.17 0.21 0.25 |
0.11 0.14 0.17 0.21 0.24 0.29 |
0.13 0.17 0.20 0.24 0.28 0.32 |
0.16 0.20 0.24 0.28 0.32 0.37 |
0.20 0.23 0.27 0.31 0.36 0.41 |
0.23 0.27 0.31 0.35 0.40 0.45 |
| 4 4 4 4 4 4 |
0 1 2 3 4 5 |
0.13 0.17 0.22 0.34 0.41 |
0.17 0.21 0.26 0.33 0.40 0.48 |
0.21 0.26 0.32 0.39 0.47 0.56 |
0.25 0.31 0.38 0.45 0.54 0.64 |
0.30 0.36 0.44 0.52 0.62 0.72 |
0.36 0.42 0.5 0.59 0.69 0.81 |
| 5 5 5 5 5 5 |
0 1 2 3 4 5 |
0.23 0.33 0.49 0.79 1.3 2.4 |
0.31 0.46 0.7 1.1 1.7 3.5 |
0.43 0.64 0.95 1.4 2.2 5.4 |
0.58 0.84 1.2 1.8 2.8 9.2 |
0.76 1.1 1.5 2.1 3.5 16 |
0.95 1.3 1.8 2.5 4.3 -- |
표 2. 이 연습에서 실험 설계와 함께 사용하기에 가장 가능성이 있는 숫자입니다.
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Applications and Summary
MPN 방법론은 프로세스 관련 기여에 따라 기능 인구의 추정을 허용하기 때문에 유용합니다. 예에서, 기능공정은 유기탄소의 부재 속에서 성장을 허용한 조류에 의해 광합성을 수행하였다. 이것은 토양에 있는 총 조류 인구가 확대될 수 있었습니다.
MPN은 또한 살모넬라와같은 물에서 특정 유형의 미생물 병원체의 수를 추정하기 위해 사용되며, 모모넬라의 저항을 활용하여 말라카이트 그린에 사용된다.
추가 적용은 식물 호스트에 토양 희석을 접종하고 곰팡이에 의한 뿌리 식민지화를 찾는 균류균의 추정이다.
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