Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

1 200 אצות באמצעות מתודולוגיה של Culturable
 
Click here for the English version

1 200 אצות באמצעות מתודולוגיה של Culturable

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ

אצות הן קבוצה הטרוגנית מאוד של מיקרואורגניזמים שיש להם תכונה משותפת אחת, כלומר החזקת פיגמנטים פוטוסינתזה. בסביבה, אצות יכולות לגרום לבעיות לבעלי בריכות השחייה על ידי גידול במים. אצות יכולות גם לגרום לבעיות במים על פני השטח, כגון אגמים ומאגרים, בשל פריחת אצות המשחררות רעלים. לאחרונה, אצות מוערכים כמקורות אנרגיה חדשניים באמצעות דלקים ביולוגיים אצות. אצות כחולות-ירוקות הן למעשה חיידקים המסווגים כציאנובקטריה. Cyanobacteria לא רק פוטוסינתזה, אלא גם יש את היכולת לתקן גז חנקן מהאטמוספירה. אצות אחרות הן אאוקריוטיות, החל מאורגניזמים חד-תאיים ועד אורגניזמים רב-תאיים מורכבים, כמו אצות. אלה כוללים את האצות הירוקות, האוגלנואידים, הדינופלגלטים, האצות החומות הזהובות, הצורניות, האצות החומות והאצות האדומות. בקרקעות, אוכלוסיות אצות הן לעתים קרובות 106 לגרם. מספרים אלה נמוכים מהמספרים המתאימים לחיידקים, אקטינומיצטים ופטריות, בעיקר משום שאור השמש הנדרש לפוטוסינתזה אינו יכול לחדור הרחק מתחת לפני הקרקע.

מכיוון שאצות הן פוטוטרופיות, מקבלות אנרגיה מפוטוסינתזה ופחמן לביומסה מפחמן דו חמצני, ניתן לגדלן במדיה של צמיחה המורכבת כולה מחומרים מזינים אנאורגניים וללא מצע פחמן אורגני. היעדר מצע אורגני מונע את צמיחת החיידקים ההטרוטרופיים. באמצעות מדיום צמיחה אנאורגני, אצות במקור נוכחים בקרקע או במים יכול להיות כמות על ידי שיטת המספר סביר ביותר (MPN). שיטת MPN מסתמכת על דילול דוגמה ברציפות, כך שהאצות עצמן מדוללות להכחדה. נוכחות של אצות בכל דילול נקבעת על ידי סימן חיובי של צמיחה במדיום, שהוא בדרך כלל רפש ירוק של אצות הנובעות פוטוסינתזה. שימוש בצינורות שכפול בכל דילול והערכה סטטיסטית של מספר הצינורות החיוביים לצמיחה בכל דילול נתון מאפשר לחשב את מספר האצות הקיימות במדגם המקורי. טבלאות MPN פותחו ופורסמו ספציפית לעיצוב MPN מסוים, כולל מספר המשכפלים המשמשים בכל דילול.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. לשקול מדגם 10 גרם של אדמה כי נאסף לח מהשדה, או היו מים הוסיף אליו, כך שהוא נשאר לח במשך 2-3 ימים. שים לב כי האדמה צריכה להיות לחה אך לא רוויה.
  2. הכן סדרת דילול פי 10 על-ידי הוספת 10 גרם אדמה ל-95 מ"ל של הפתרון של בריסטול שונה(איור 1). כדי ליצור פתרון בריסטול שונה, להמיס את הדברים הבאים ב 1,000 מ"ל של מים: 0.25 גרם NaNO3, 0.025 גרם CaCl2, 0.075 גרם MgSO-4 · 7H2O, 0.075 גרם K2HPO4,0.018 גרם KH2PO4, 0.025 גרם NaCl, ו 0.5 מ"ג FeCl3.
  3. המשך סדרת הדילול על ידי תוספת של 1 מ"ל של השעיה A עד 9 מ"ל של הפתרון של בריסטול ודילולים רציפים נוספים.
  4. לחסן 5 צינורות לשכפל כל אחד המכיל 9 מ"ל של פתרון בריסטול שונה עם 1 מ"ל כל דילול 10-2 עד 10-6 (טבלה 1).
  5. לדגור על הצינורות capped עד 4 שבועות באזור חשוף לאור השמש.
  6. שימו לב לצינורות לצמיחת אצות אחת ל-7 ימים. צינורות עם צמיחת אצות נראים ירוקים.

Figure 1
איור 1. כיצד ליצור סדרת דילול פי 10.

צינור דילול
B 10-2
C 10-3
D 10-4
E 10-5
F 10-6

טבלה 1. צינורות ודילולים.

אצות הן אורגניזמים פוטוסינתזיים שחיים במגוון סביבות. אצות מגורים בקרקע ניתן לתרבות במעבדה, והריכוז שלהם נמדד באמצעות חישובים פשוטים.

אצות הן קבוצה הטרוגנית מאוד של אורגניזמים שיש להם תכונה משותפת אחת, כלומר החזקה של פיגמנטים פוטוסינתזה, בדרך כלל כלורופיל. הרוב המכריע של האצות הן מיקרוסקופיות, עם זאת, ההגדרה המדויקת של הקבוצה שנויה במחלוקת, וכוללת גם אצות, שהן בדרך כלל מקרוסקופיות.

בסביבה, אצות יכולות לגרום לבעיות במים על פני השטח כגון אגמים או מאגרים, יצירת פריחות אצות המרוקנות את החומרים המזינים של המים, חוסמות אור העובר מעבר לפני המים ומשחררות רעלים. היכולת למנות אצות בדגימות מאפשרת למדענים להעריך את בריאות המערכת האקולוגית ואת הסיכון הפוטנציאלי לגידול יתר של אצות.

אוכלוסיות אצות בקרקעות מתרחשות לעתים קרובות בסביבות עשרת אלפים תאים לגרם. מספרים אלה בדרך כלל נמוכים יותר מריכוזים מקבילים של חיידקים, פטריות או אקטינומיצטים, שכן אצות דורשות אור שמש לפוטוסינתזה, שאינה יכולה לחדור הרחק מתחת לפני הקרקע.

וידאו זה ימחיש כיצד לתרבות אצות מאדמה במעבדה, וכיצד למנות את ריכוז האצות בדגימת הקרקע ההתחלתית.

לאצות יש השפעות מועילות על מערכות אקולוגיות. אצות כחולות-ירוקות, או ציאנובקטריה, יש את היכולת לתקן גז חנקן מהאטמוספירה, מה שהופך אותם שימושיים בהגדלת חנקן הקרקע בסביבות צחיחות למחצה וגם ככלי פוטנציאלי לייצור דלק ביולוגי.

אצות אחרות הן אאוקריוטיות, והן נעות בין אורגניזמים חד-תאיים לאורגניזמים רב-תאיים מורכבים, כמו אצות. אלה כוללים אצות ירוקות, אוגלנואידים, דינופלגלטים וצניות, אצות חומות ואצות אדומות.

אצות הן פוטוטרופיות, מקבלות אנרגיה מפוטוסינתזה ופחמן לביומסה מפחמן דו חמצני. כתוצאה מכך, הם יכולים לגדול במדיה המורכבת כולה של חומרים מזינים אנאורגניים, ללא מצע פחמן אורגני נוסף. חוסר זה של מצע אורגני מונע את הצמיחה של חיידקים הטרוטרופיים, אשר תלויים פחמן אורגני חיצוני לצמיחה.

כדי לתרבות אצות לספירה, דגימות הקרקע מדוללות באופן סדרתי פי עשרה עד 10-6 גרם אדמה למ"ל, ומתרבתות במדי צמיחה. מספר שכפולים מיוצרים עבור כל דילול. לאחר מכן הם דוגרים באזור מואר היטב עד 4 שבועות כדי לאפשר צמיחה אצות.

נוכחות של אצות בכל דילול נקבעת על ידי סימן חיובי של צמיחה במדיום, אשר יופיע בדרך כלל כרפש ירוק. לבסוף, טבלאות MPN שפותחו באופן אמפירי המיועדות לצמיחת אצות מתייעצות, ומאפשרות למשתמש לקבוע את ריכוז האצות המקורי בהתבסס על צמיחה בשכפולים של דילול. שיטת MPN מסתמכת על דילול סדרתי של דגימות כך שהאצות מדוללות להכחדה, כלומר בדילול מסוים, לא מתפתחת צמיחה אצות.

כעת, כאשר אנו מכירים את המושגים העומדים מאחורי גידול והספירה של אצות מדגימות, בואו נסתכל על האופן שבו זה מתבצע במעבדה.

כדי להתחיל את הניסוי, משקל ראשון 10 גרם של אדמה לחה כי כבר נאסף לח מהשטח, או rehydrated ונשאר לח במשך 2 עד 3 ימים. האדמה צריכה אך לא רוויה.

לאחר מכן, להכין סדרת דילול פי עשרה על ידי הוספת 10 גרם של אדמה הראשון ל 95 מ"ל של הפתרון של בריסטול שונה, או MBS. תייג זאת כהשעיה א'.

לאחר רועד במרץ, להמשיך את סדרת דילול על ידי הוספת 1 מ"ל של השעיה A ל 9 מ"ל של MBS במבחנה. המשך סדרת דילול זו פי עשרה עוד 4 פעמים כדי לתת דילול עד10-6 גרם למ"ל.

לאחר מכן, לחסן 5 צינורות לשכפל, כל אחד מכיל 9 מ"ל של MBS עם 1 מ"ל של כל דילול 10-1 עד 10-5. התוצאה היא 5 צינורות משכפלים עבור כל דילול מ 10-2 ל 10-6. כיפה הצינורות באופן רופף.

לבסוף, לדגור על הצינורות במשך 4 שבועות מלאים באזור חשוף לאור השמש. שימו לב לצינורות לצמיחת אצות אחת ל-7 ימים. צינורות המציגים צמיחת אצות ייראו ירוקים.

רוב המספרים סבירים, או MPN, ניתוח הוא שיטה מתמטית נפוצה כדי למנות מיקרואורגניזמים גדל מדילול של מצע ראשוני מרוכז. על ידי התחשבות בגורמי הדילול של הפתרונות, ובמספר הצינורות המראים סימנים חיוביים של צמיחה בכל דילול, ניתן לחשב את המספר הסביר ביותר של אורגניזמים לגרם של דגימת קרקע מקורית באמצעות טבלת MPN ונוסחה פשוטה.

כדי לחשב MPN, הדילול הגבוה ביותר עם המספר הגבוה ביותר של צינורות שכפול חיובי מוקצה התווית של p1, במקרה זה, שכפולים של צינור C. לעומת זאת, חלק הצינורות מ- D & E שליליים ללא סימנים של צמיחה אצות.

מספר הצינורות בשני הדילולים הגבוהים הבאים המציגים צמיחה חיובית מסומנים כ- p2 ו- p3. כאן, p2 = D ו- p3 = E.

ניתן למצוא את הערך עבור p1 על-ידי התבוננות בעמודה הראשונה בטבלת MPN. אותו הדבר צריך להיעשות עם העמודה p2. לבסוף, הערך של p3, על פני החלק העליון, משמש כדי להצטלב בין השניים המוגדרים על ידי עמ'1 ו p 2 , כדי לתת ערךשל המספר סביר ביותר של אורגניזמים לכל mL.

לאחר מכן, כדי לחשב את ריכוז האורגניזמים לגרם בדגימת הקרקע המקורית, ערך זה מחולק על ידי ריכוז הקרקע בדילול שאליו הוקצה p2. המשוואה הבאה משמשת להגדרת המספר הממשי של אורגניזמים לגרם אדמה.

הספירה האצות וניתוח MPN יש מגוון רחב של יישומים, שחלקם נחקרים כאן.

שיטה פולחנית זו של הספירה האצות ניתן להשתמש במגוון רחב של הגדרות. זה יכול להיות מיושם על נהרות או אגמים כדי לקבוע את רמות האצות, ולהעריך את הסיכונים של פריחת אצות מזיקות. לחלופין, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הניקיון והבטיחות של מים בשימוש ישיר יותר על ידי בני אדם, כולל בריכות שחייה, מזרקות מים, או מקורות מי שתייה אחרים. באופן אידיאלי, בדגימות מים ראויות לשתייה ובבריכות שחייה, אין אצות.

ניתוח MPN לספירה יכול להיות מיושם גם על מיקרואורגניזמים אחרים שאינם אצות. לדוגמה, ניתן להעריך את איכות המים באמצעות אורגניזמים אינדיקטור כגון קוליפורמים או E. coli. כאן, דגימות ניתן לתרבות עם מדיה המכילה כימיקלים כי הם השתנו כדי לייצר צבע או פלואורסצנטיות בנוכחות אורגניזמים אינדיקטור. על ידי ביצוע שכפולים קטנים מרובים של ניסוי זה בתאים בודדים, עם דגימות מדוללות לריכוז ידוע, ניתן להפנות את היחס בין תאים חיוביים לטבלת MPN עבור האורגניזם אינדיקטור ספציפי, ואת הריכוז ההתחלתי בדגימות שנקבעו.

אצות עשויות גם להיות תרבותיות עבור יישומים מסחריים. לדוגמה, סוגים מסוימים של ביו-פוריות משתמשים באצות כחולות-ירוקות, שיכולות לשמש כסימביונים עם צמחים, ומסייעות למתקן שלהם ולתפוס חנקן, וזה שימושי במיוחד בסיוע לגידול היבול באזורים עם אדמה גרועה. באופן דומה, אצות ניתן לגדל עבור דלקים ביולוגיים, או כמקור של מזון עשיר בחומרים מזינים עבור בעלי חיים.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לתרבות האצות ולפי הספירה. עכשיו אתה צריך להבין איך לדלל דגימות קרקע לצמיחת אצות, איך לתרבות אצות במעבדה, וכיצד למנות את ריכוז האצות של דגימות ההתחלה שלך. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 2 הוא דוגמה לתוצאות מייצגות.

עמ'1 נבחר להיות מספר הצינורות המשוכפלים של הדילול הגבוה ביותר (הכי פחות מרוכז באדמה) שיש לו את המספר הגבוה ביותר של צינורות חיוביים. כאן, המשכפלים מצינור B אינם נחשבים, כי אלה של Tube C הם מדילול גבוה יותר. לעומת זאת, מספר הצינורות מצינור D המראים סימן חיובי לצמיחה נמוך מזה של Tube C. אז, עמ'1 = 5.

עמ'2 ו-עמ'3 נבחרים להיות מספר הצינורות בשני הדילולים הגבוהים הבאים המראים סימן חיובי לצמיחה. לכן, עמ'2 = 3 ו- p3 = 1.

ניתן למצוא את הערך עבור p1 על-ידי התבוננות בעמודה הראשונה בטבלה 2. אותו הדבר נעשה בעמודה עמ'2. לאחר מכן, הערך של p3 (לרוחב החלק העליון) מצטלב בין השניים המוגדרים על-ידי הערכים של p1 ו- p2. בדוגמה זו, הערך הוא 1.1 אורגניזמים לכל מ"ל.

חלק ערך זה בריכוז האדמה בדילול שאליו הקצית עמ '2. בדוגמה זו, זהו צינור D.

Equation 1

לכן, בדוגמה זו, היו 1.1 x 104 תאי אצות לכל גרם של אדמה. ערך זה אופייני למדי למספר האצות שנמצאות באדמה.

Figure 2
איור 2. תוצאה היפותטית של ניסוי הספירה של אצות. צינורות מוצלים מצביעים על נוכחות של אצות. צינורות לא מוצלים מייצגים את היעדר האצות.

המספר הנידון ביותר עבור ערכים שצוינו של p3
עמ' 1 עמ' 2 0 1 2 3 4 5
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
--
0.018
0.037
0.056
0.075
0.094
0.018
0.036
0.055
0.074
0.094
0.11
0.036
0.055
0.074
0.093
0.11
0.13
0.054
0.073
0.092
0.11
0.13
0.15
0.072
0.091
0.11
0.13
0.15
0.17
0.090
0.11
0.13
0.15
0.17
0.19
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
4
5
0.020
0.040
0.061
0.083
0.11
0.13
0.040
0.061
0.082
0.1
0.13
0.16
0.060
0.081
0.10
0.13
0.15
0.17
0.080
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.22
0.12
0.14
0.17
0.19
0.22
0.24
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
4
5
0.045
0.068
0.093
0.12
0.15
0.17
0.068
0.092
0.12
0.14
0.17
0.20
0.091
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.26
0.14
0.17
0.19
0.22
0.25
0.29
0.16
0.19
0.22
0.25
0.28
0.32
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
0.078
0.11
0.14
0.17
0.21
0.25
0.11
0.14
0.17
0.21
0.24
0.29
0.13
0.17
0.20
0.24
0.28
0.32
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.37
0.20
0.23
0.27
0.31
0.36
0.41
0.23
0.27
0.31
0.35
0.40
0.45
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
0.13
0.17
0.22

0.34
0.41
0.17
0.21
0.26
0.33
0.40
0.48
0.21
0.26
0.32
0.39
0.47
0.56
0.25
0.31
0.38
0.45
0.54
0.64
0.30
0.36
0.44
0.52
0.62
0.72
0.36
0.42
0.5
0.59
0.69
0.81
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
0.23
0.33
0.49
0.79
1.3
2.4
0.31
0.46
0.7
1.1
1.7
3.5
0.43
0.64
0.95
1.4
2.2
5.4
0.58
0.84
1.2
1.8
2.8
9.2
0.76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0.95
1.3
1.8
2.5
4.3
--

טבלה 2. המספרים ה סבירים ביותר לשימוש עם העיצוב הניסיוני בתרגיל זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מתודולוגיית MPN שימושית, מכיוון שהיא מאפשרת הערכה של אוכלוסייה פונקציונלית בהתבסס על ייחוס הקשור לתהליך. בדוגמה, התהליך הפונקציונלי היה פוטוסינתזה שבוצעה על ידי אצות, אשר אפשר צמיחה בהיעדר פחמן אורגני. זה איפשר למנות אוכלוסיות אצות מוחלטות בקרקע.

MPN משמש גם להערכת מספר סוג מסוים של פתוגנים מיקרוביאליים במים, כגון סלמונלה, תוך שימוש בהתנגדות של סלמונלה לירוק מלאכיט.

יישום נוסף הוא הערכה של פטריות mycorrhizal על ידי חנק דילול הקרקע על מארח צמח וחיפש קולוניזציה שורש על ידי הפטריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter