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高速液体クロマトグラフィー (HPLC)
 

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

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高速液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーは、固定相との別の相互作用に基づく液体の混合物のコンポーネントを分離する汎用性の高い手法です。

HPLC は、カラム ・ クロマトグラフィの翻案であります。カラム ・ クロマトグラフィで列は固定相と呼ばれる微小ビーズが満載です。固定相ビーズは、ビーズと液体、または携帯電話の段階である混合物のコンポーネント間の相互作用を誘発する化学グループと官能基化します。混合物は列に流れる、コンポーネントは異なる固定相と対話します。

Hplc カラム ・ クロマトグラフィ、高いフローで実行されますレート、および古典的なカラム ・ クロマトグラフィ以上のため高圧。これは、小さい固定相ビーズ移動相、固定相とコンポーネントの相互作用が大幅に増加する容積の比率に大きい表面領域を使用できます。

様々 なダイエット炭酸飲料の成分の分離を示すことによって高速液体クロマトグラフィーの操作の基本を紹介します。

実験室で使用される高速液体クロマトグラフィーの 2 種類があります: 分析、および分取。分析 HPLC で小さなボリュームのコンポーネントの識別に使用される、楽器と解析サンプルは廃棄物として破棄されます。分取 HPLC で測定器、浄化分数で混合物と各コンポーネントの必要な量を収集するために使用されます。

高速液体クロマトグラフィー計測は、一連の単純なコンポーネントで構成されています。まず、溶剤タンクで開催、移動相は一定の流量で 1 つまたは複数のポンプによってシステムから流されています。サンプルは、サンプル注入器によって移動相の流れに注入されます。移動相で希釈サンプルは、サンプルのコンポーネントが区切られている HPLC カラムに配信されます。コンポーネントは、検出器と分数を後で使用するために保存または廃棄ボトルに転送によって分析しています。

HPLC カラムは、システムに重要なコンポーネントです。それは静止した段階やクロマトグラフィー樹脂のマイクロ ビーズが満載、金属またはプラスチック シリンダーで構成されます。サンプル混合物が一定流量で充填粒子充填層を流れる各コンポーネントとのやり取りの固定相で流れる。

化合物と対話する固定相と異なる、異なる速度で検出器列の長さを旅。列を終了または、溶出するコンポーネントに必要な時間は、保存期間と呼ばれます。結果は、強度、対時間のプロットまたはクロマト グラムです。保持時間は、コンポーネントの識別に使用されます。最初のソリューションの化合物の量を定量化する具体的、ピークの下の領域のピーク サイズを使用します。

固定相の選択は、サンプル混合物のコンポーネントのプロパティに依存します。最もよく使われる固定相はシリカビーズ、不活性の無極性物質微小ビーズを形成し、十分な充填密度を実現しています。高速液体クロマトグラフィーの最も一般的なタイプは、通常シリカ ビーズ C18 鎖ビーズの表面に疎水性固定相を利用した逆相クロマトグラフィーです。コンポーネントは、極性の順に溶出されます。

逆相クロマトグラフィーの移動相は通常水とアセトニ トリルなどの有機溶媒の混合物であります。移動相が水と有機溶媒の比が一定のまま、サンプルの種類に応じてイソクラティック モードとして知られています。ただし、これは高含水の場合、広範なピークまたは重複ピークにつながることができます-有機含有量が高い場合。

移動相のグラデーションを作成する、分離中に直線的または段階的移動相比を変更もできます。グラジエント溶離法は、ピーク拡がりより極性成分の分離が向上、溶出時間の短縮を防ぐことができます。

今では高速液体クロマトグラフィーの基礎に概説されている、高速液体クロマトグラフィー法は、実験室で実証されます。この実験では高速液体クロマトグラフィーは、分離し、ダイエット ソーダの 3 つの一般的なコンポーネントが定量化されます。

まず、移動相を準備するには、1.5 L の脱イオン水に 400 mL のアセトニ トリルを追加します。慎重に 2.4 mL の氷酢酸を加えます。希薄溶液を 2 L の総ボリューム得られた溶液 pH 2.8 と 3.2 の間が必要です。

40% を追加して 4.2 に pH を調整する drop-wise 校正 pH メーターを使用での攪拌溶液に NaOH。

ドガのソリューションおよび列を差し込むことができる固体を削除する真空下で 0.47 μ m メンブラン フィルター移動相をフィルターします。ドガのソリューションは、泡が静止した段階のボイドが発生または検出器セルに彼らの方法を作業し、測定が不安定になることが重要です。

ダイエット炭酸飲料の 3 つの典型的なコンポーネントは、カフェイン、安息香酸、アスパルテームの 3 つのコンポーネント ソリューションを準備します。これらのコンポーネントのソリューションは、未知数の決定に利用する標準溶液を準備する使用されます。カフェインと安息香酸のソリューションの 500 mL を準備します。

アスパルテーム コンポーネント溶液 100 mL を準備します。分解を避けるために使用しない時は冷蔵庫でソリューションを保存します。

次に、カフェイン、安息香酸、アスパルテームの濃度の異なる各 7 標準溶液を準備します。ピペット、メスフラスコに、希を移動相 50 mL マークに各コンポーネントの適切な量です。

まず 3 の解決策には、ピーク同定できるように、1 つのコンポーネントが含まれています。4、他のソリューションは、濃度にピーク高さを関連付けるためにすべての 3 成分濃度の範囲を含まれています。

サンプル ラックでラベル付けされたバイアルに各標準溶液を注ぐ。サンプル ラックのサンプルとソリューションの残りを冷蔵庫に保管します。

まず、移動相と廃棄物コンテナーを設定します。廃棄物線廃棄物コンテナーに与えられる移動相に戻すリサイクルを行っていないことを確認します。入口移動相線が移動相コンテナーに送られることを確認します。

移動相の流量を 0.5 mL/min に設定されていることを確認します。この流量は 5 分以内に溶出するすべてのコンポーネントを有効にするが、個々 のピークの解像度を確保するために十分な速度です。

次に、溶剤の配信システムに最小値と最大圧力を確認します。これらの設定を切ってポンプ漏れや詰まり、それぞれ。

空白を設定するのには、検出器のフロント パネルの「ゼロ」を押します。100 μ L のシリンジ 7 作業標準の 1 の複数のボリュームとし、脱イオン水ですすいでください。そのソリューションとは、注射器を記入してください。各コンポーネントのピークを識別するために 3 の単一コンポーネントのサンプルから始まります。

次に、手動で、溶液を注入して、インジェクターを配置することによって処理負荷の位置で。ゆっくりと中隔ポートを介してソリューションの 100 μ L を注入します。

300 のデータを収集するデータ収集プログラムが設定されていることを確認 s 検出器から溶出するすべての 3 のピークに十分な時間を可能にします。トライアルを開始する準備ができて、移動相にサンプルを注入するために、インジェクター ハンドルを挿入位置を回転します。すぐ、データ収集プログラムに「試験開始」をクリックしてします。スキャンが完了したら、各 7 標準ソリューションのプロセスを繰り返します。まず 3 の基準ごとに、3 のピークの 1 つだけが表示されます。コンポーネントの識別に使用されるピークの位置に注意してください。

選択 3 はダイエット ソーダ サンプルと中性化を削除するに一夜開いた容器に座ってできるように。

一晩脱ガス後プラスチック注射器にそれぞれのダイエット ソーダの約 3 mL を描画します。次に、フィルター先端を注射器に接続し、任意の固形粒子を除去するためにフィルターをガラスの瓶にソーダをプッシュします。

2 ml のソーダ濃度を半減する移動相の各サンプル 2 mL を希釈します。

、注射器に 100 μ L のソーダのサンプルの 1 つを描画し、サンプル ループに挿入します。標準溶液を同じパラメーターで裁判を実行します。ソーダ サンプルごとに繰り返します。

まず、既知の濃度の標準試料のピーク面積を関連付けます。これを行うには、三角形のメソッドを使用して各標準試料のクロマト グラフのピーク面積を決定します。高さの半分の幅にピーク高さを計算してピーク領域としてこの値を使用します。

ピーク面積と既知濃度を使用して各コンポーネントの検量線を作成し、各校正曲線の最小二乗法フィットを決定します。

ピーク面積からダイエット ソーダで各成分の濃度を計算します。炭酸飲料が、HPLC に注入する前に 2 倍に希釈されたことを覚えてください。これらの結果に基づいて、ソーダの 12 オンス缶内の各コンポーネントの mg を計算します。

当然のことながら、テストすべて 3 炭酸飲料はほぼ同量防腐剤の安息香酸の含まれています。しかし、コーラ製品にはカフェインが含まれています。すべてのコンポーネントの計算結果の値は、製造業者によって報告された値によく相関。

高速液体クロマトグラフィーは、分析の広い範囲で使用されている汎用性の高い楽器です。

高速液体クロマトグラフィーは、ペプチド分子を浄化するためにしばしば使用されます。この例では、貫通型ペプチド複合体は準備され、ジスルフィド結合の蛋白質を酸化的架橋によって安定化されました。

蛋白質, ギ酸に溶解し、精製を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー。サンプルはそれから 2 つの溶媒の線形グラデーションを使用して溶離され、質量分析法と純度を確認しました。

高速液体クロマトグラフィーは、実験室で合成した有機化合物を識別するためにも使用できます。ユーリー-ミラーの実験では、原始地球上の有機物の無生物的合成を検討しました。始原ガス、メタン、アンモニアなどは、水を含む、初期の海をシミュレートするフラスコに導入されました。放電し、原始地球上の雷を模倣して適用されました。

水、高速液体クロマトグラフィー質量分析法と相まって、知られているアミノ酸規格と比較して用いていた。23 アミノ酸を合成し、この実験で特定しました。

ゼウスの HPLC 入門を見てきただけ。楽器を実行し、結果のデータを分析の基本を理解する必要があります今すぐ。

見てくれてありがとう!

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