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Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
 

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

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Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC, ist eine äußerst vielseitige Technik, die Komponenten einer flüssigen Mischung basierend auf unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der stationären Phase trennt.

HPLC ist eine Anpassung der Säulenchromatographie. In Säulenchromatographie steckt eine Spalte mit Mikromaßstab Perlen die stationäre Phase genannt. Die stationäre Phase-Perlen sind mit chemischen Gruppen funktionalisiert, die eine Interaktion zwischen der Wulst und die Bestandteile einer Mischung befindet sich in der Flüssigkeit oder mobile Phase auslösen. Die Mischung fließt durch die Spalte, interagieren die Komponenten mit der stationären Phase anders.

In HPLC, Säulenchromatographie erfolgt auf einer höheren Durchfluss, und daher höheren Druck als klassische Säulenchromatographie. Dies ermöglicht den Einsatz von kleineren stationären Phase Perlen mit einer größeren Fläche Volumen-Verhältnis, das die Interaktion der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase erhöht.

Dieses Video werden die Grundlagen des Betriebs der HPLC vorstellen, durch den Nachweis der getrennten Bestandteile der verschiedenen Diät-Limonaden.

Es gibt zwei Arten von HPLC verwendet im Labor: analytische und präparative. In analytischen HPLC das Gerät dient zum identifizieren Komponenten eines kleinen Volumens und die analysierten Probe ist dann als Abfall weggeworfen. Bei präparativen HPLC dient das Instrument reinigen eine Mischung und eine gewünschte Menge der einzelnen Komponenten erfolgt in Sekundenbruchteilen.

Die HPLC-Instrumentierung besteht aus einer Reihe von einfachen Komponenten. Erstens ist die mobile Phase, gehalten in Lösungsmittel Stauseen, durch eine oder mehrere Pumpen bei konstantem Volumenstrom durch das System gepumpt. Die Probe wird in der mobilen Phase Strom durch die Probe-Injektor eingespritzt. Die Probe durch die mobile Phase verdünnt wird dann für die HPLC-Säule geliefert wo die Komponenten der Probe getrennt werden. Die Komponenten werden dann durch den Detektor und entweder in Sekundenbruchteilen zur späteren Verwendung gespeichert oder übertragen einer Abfallflasche analysiert.

Die HPLC-Säule ist die zentrale Komponente des Systems. Es besteht aus einem Metall- oder Zylinder, vollgepackt mit Mikromaßstab Perlen der stationären Phase oder Chromatographie Harz. Das Probe-Gemisch fließt durch das gepackte Partikel Bett bei konstantem Volumenstrom und jede Komponente interagiert mit der stationären Phase, wie es durch fließt.

Die Verbindungen zu interagieren mit der stationären Phase anders, und daher Reisen über die gesamte Länge der Spalte mit dem Detektor mit einer anderen Geschwindigkeit. Der Zeitaufwand für eine Komponente, um die Spalte zu beenden, oder eluieren, wird die Retentionszeit genannt. Das Ergebnis ist eine Handlung der Retentionszeit vs. Intensität oder ein Chromatogramm. Die Retentionszeit wird verwendet, um die Komponente zu identifizieren. Die Maximalgröße, speziell der Bereich unter dem Gipfel wird verwendet, um die Menge der Verbindung in der Ausgangslösung zu quantifizieren.

Die Wahl der stationären Phase hängt von den Eigenschaften der Komponenten in der Probe-Mischung. Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist Kieselsäure Perlen, wie sie einem unpolaren Inertmaterial, Mikromaßstab Perlen bildet, und ausreichend Packungsdichte erreicht. Die häufigste Art der HPLC ist umgekehrt-Phase Chromatographie, die eine hydrophobe stationäre Phase, in der Regel Silica Beads mit C18-Ketten gebunden an die Perlen Oberfläche nutzt. Die Komponenten sind in der Reihenfolge abnehmender Polarität eluiert.

Die mobile Phase in umgekehrt-Phase Chromatographie verwendet wird in der Regel eine Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril. Abhängig von der Probe kann die mobile Phase ein konstantes Verhältnis von Wasser und organischen Lösungsmitteln, bleiben als isokratischen Modus bekannt. Allerdings kann dies zu breiten Gipfel, bei hohem Wassergehalt oder überlappende Peaks – bei hohen organischen Inhalt.

Der mobilen Phasenverhältnis kann auch während der Trennung, erstelle ich einen mobilen Phase Farbverlauf linear oder schrittweise geändert werden. Ein gradient Elution kann verhindern, dass Peak Verbreiterung der weniger polaren Komponenten, wodurch die Trennung und Verkürzung der Elution.

Nun, da die Grundlagen der HPLC skizziert haben, wird die HPLC-Technik im Labor nachgewiesen werden. In diesem Experiment wird HPLC verwendet werden, zu trennen und drei gemeinsame Komponenten der Diät-Cola zu quantifizieren.

Fügen Sie zunächst um die mobile Phase vorzubereiten, 400 mL Acetonitril bis 1,5 L des gereinigten deionisiertes Wasser. Dann sorgfältig 2,4 mL Eisessig hinzugeben. Verdünnen Sie die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 2 L. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 und 3,2 aufweisen.

Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % NaOH tropfenweise auf die bewegende Lösung mit dem Einsatz von einem kalibrierten pH-Meter.

Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-μm-Membranfilter unter Vakuum zu entgasen der Lösung und Entfernen von Feststoffen, die die Spalte stecken könnte. Es ist wichtig, die Lösung zu entgasen, wie Luftblasen können dazu führen, Hohlräume in der stationären Phase dass oder ihre zu der Detektorzelle Weise und Instabilität in Messungen verursachen.

Bereiten Sie drei Komponentenlösungen Koffein Natriumbenzoat und Aspartam, die drei typischen Komponenten der Diät Limonaden sind. Diese Komponentenlösungen dienen dann die Standardlösungen vorzubereiten, die verwendet wird, um die unbekannte zu bestimmen. 500 mL Koffein und Benzoat Lösungen vorzubereiten.

100 mL Aspartam-Komponentenlösung vorzubereiten. Lagern Sie die Lösung im Kühlschrank bei Nichtgebrauch Zersetzung zu vermeiden.

Als nächstes bereiten Sie 7 standard-Lösungen, jeweils mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein, Benzoat und Aspartam. Pipettieren die richtige Menge an jede Komponente in einem volumetrischen Kolben und verdünnte bis zur 50-mL-Markierung mit mobilen Phase.

Die ersten 3 Lösungen enthalten eine Komponente, um Gipfel Identifikation zu ermöglichen. Die anderen 4 Lösungen enthalten eine Reihe von Konzentrationen aller 3 Komponenten, um Peakhöhe Konzentration korrelieren.

Gießen Sie jede standard-Lösung in einem beschrifteten Fläschchen in einem Probenrack. Lagern Sie die Probenrack mit Proben und den restlichen Lösungen im Kühlschrank.

Zuerst richten Sie die mobile Phase und Abfallbehälter. Sicherstellen Sie, dass die Abfälle Linien in einen Abfallcontainer fließen und sind nicht wieder in der mobilen Phase recycling. Sicherstellen Sie, dass der Saugleitung der mobilen Phase in der mobilen Phase Behälter eingespeist wird.

Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dieser Volumenstrom ermöglicht es alle Komponenten, um innerhalb von 5 min eluieren, aber ist langsam genug, um die Auflösung der einzelnen Peaks zu gewährleisten.

Überprüfen Sie anschließend, den minimalen und maximalen Druck auf Lösungsmittel Liefersystem. Diese Einstellungen abschalten die Pumpe im Falle einer Leckage oder verstopfen, beziehungsweise.

Drücken Sie "Null" auf der Frontplatte Detektoren, die Leerzeichen gesetzt. Spülen einer 100 μl Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden 1 der 7 Arbeitsstandards. Dann füllen Sie die Spritze mit dieser Lösung. Beginnen Sie mit den 3 Einkomponenten-Proben um die Spitze der einzelnen Komponenten zu identifizieren.

Anschließend manuell die Lösung zu injizieren, indem man den Injektor Griff in die Ladeposition. Injizieren Sie langsam die 100 μl der Lösung durch das Septum Port.

Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend Zeit für alle 3 Gipfel, durch den Detektor eluieren ermöglicht. Wenn Sie bereit sind, den Test zu starten, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position, um die Probe in der mobilen Phase zu injizieren. Klicken Sie an "Prüfung starten" sofort Datenbeschaffungsprogramm. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wiederholen Sie den Vorgang für jede der 7 standard-Lösungen. Für jede der ersten 3 Standards wird nur eines der 3 Gipfel. Notieren Sie den Speicherort des Peaks, die verwendet wird, um die Komponente zu identifizieren.

Wählen Sie 3 Diät Soda Proben und lassen sie in offenen Behältern über Nacht um die Kohlensäure zu entfernen, draußen zu sitzen.

Ziehen Sie nach Übernachtung Entgasung ca. 3 mL jede Diät-Cola in einer Kunststoffspritze. Als nächstes die Spritze beimessen Sie eine Filterspitze, und drücken Sie die Soda durch den Filter in eine Glasflasche um festen Partikel zu entfernen.

Verdünnen Sie 2 mL jeder Probe mit 2 mL der mobilen Phase, die Soda-Konzentration um die Hälfte zu verringern.

100 μl eines Soda-Proben in eine Spritze zu ziehen und in die Probenschleife injizieren. Führen Sie die Testversion mit identischen Parametern zu den Standardlösungen. Wiederholen Sie für jede Probe Soda.

Erstens korrelieren Sie die Peakflächen der standard Proben mit den bekannten Konzentrationen. Hierzu bestimmen Sie die Peakflächen auf den Chromatographen für jede standard Probe mit der dreieckigen Methode. Berechnen Sie die Peak-Höhe-Zeiten mit der Breite bei der Hälfte der Höhe zu, und verwenden Sie diesen Wert als die Peakfläche.

Mithilfe der Peakflächen und bekannte Konzentrationen erstellen Sie eine Kalibrierkurve für jede Komponente zu und bestimmen Sie der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.

Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen. Beachten Sie, dass die Limonaden waren alle um den Faktor 2 vor der Injektion in der HPLC verdünnt. Basierend auf diesen Ergebnissen, berechnen Sie die mg jede Komponente in der 12-Unze-Dose Soda.

Es überrascht nicht, enthalten alle 3 Limonaden getestet etwa die gleiche Menge an das Konservierungsmittel Natriumbenzoat. Jedoch enthalten die Cola-Produkte mehr Koffein. Die berechneten Werte für alle Komponenten korreliert gut mit Werten von den Herstellern.

HPLC ist ein sehr vielseitiges Instrument, das in eine Vielzahl von Analysen verwendet wird.

HPLC wird häufig verwendet, um Peptid Moleküle zu reinigen. In diesem Beispiel transmembranen Peptid-komplexe vorbereitet wurden, und dann stabilisiert durch oxidative Vernetzung der Proteine mit Disulfid-Bindungen.

Die Proteine wurden dann in Ameisensäure aufgelöst, und gereinigten mit Phase HPLC storniert. Die Probe wurde dann eluiert mit einem linearen Farbverlauf der beiden Lösungsmittel, und die Reinheit mit Massenspektrometrie bestätigt.

HPLC kann auch verwendet werden, um organische Verbindungen synthetisiert im Labor zu identifizieren. In der Miller-Urey-Experiment wurde die abiotische Synthese von organischen Verbindungen auf der ursprünglichen Erde untersucht. Primordial Gase wie Methan und Ammoniak, wurden in ein Fläschchen mit Wasser, Simulation der frühen Ozeane eingeführt. Elektrischer Entladung wurde dann angewendet, Blitz auf der Ur-Erde zu imitieren.

Das Wasser wurde dann analysiert mittels HPLC mit der Massenspektrometrie gekoppelt, und im Vergleich zu bekannten Aminosäure-Standards. 23 Aminosäuren wurden synthetisiert und in diesem Experiment identifiziert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in HPLC beobachtet. Sie sollten nun die Grundlagen der läuft des Geräts, und die Analyse der resultierenden Daten verstehen.

Danke fürs Zuschauen!

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