Overview
Source : Laboratoire de Jeff Sanoussi - University of Massachusetts Amherst
Tel que mentionné dans les vidéos précédentes, le produit d’une extraction par solvant organique, un extrait de lipides totaux (TLE), est souvent un mélange complexe de centaines, voire des milliers de différents composés. Le chercheur est souvent seulement intéressé par une poignée de composés. Dans le cas de nos deux paleothermometers organiques (Uk'37 et MBT/CBT), l’intérêt est de seulement 6 composés (2 alkénones et 4 isoprenoidal glycérol dialkyl tetraethers de glycérol). Tel que discuté dans les deux vidéos précédentes de cette série, les techniques de purification peuvent être appliquées afin de réduire le nombre des composés présents dans l’échantillon analysé. Ces techniques peuvent modifier les éléments non désirés (saponification) chimiquement, profitez des chimies différentes composés (chromatographie sur colonne) ou utiliser les différentes formes et tailles des molécules pour inclure ou exclure certains éléments de l’analyse (adduction de l’urée). La structure atomique des différents produits chimiques conduit certains composés organiques pour former de longues, étroites, chaînes droites (n-alcanes et alkénones), autres composés organiques pour former des structures cycliques complexes, d’autres pour former des structures hautement ramifiés, et encore d’autres qui forment les deux cycliques et ramifiée structures (GDGTs) (Figure 1). Les différentes formes et tailles des composés dans un échantillon peuvent servir à séparer l’un de l’autre, la même manière comme une trieuse de pièces sépare les pièces de différentes confessions (tailles).
Figure 1. Comparaison de différentes structures chimiques. Décane, un alcane droit-enchaînés (A ; à partir de http://www.bpc.edu/mathscience/chemistry), cyclohexane, un alcane cyclique (B ; de http://www.bpc.edu/mathscience/chemistry), un stéroïde, un hydrocarbure polycycliques (C ; de www.wikiwand.com) et 2, 2-diméthylbutane, un alcane ramifié (D ; www.wikimedia.com). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Principles
Adduction de l’urée est une technique d’exclusion de taille qui sépare droit-enchaînée ou rarement ramifiée structures structures hautement ramifiés et cycliques. Cela arrive à cause de la structure cristalline particulière de l’urée (Figure 2). Lorsqu’une urée cristal crée, il crée de minuscules espaces entre les cristaux individuels. Les espaces sont longues et étroites avec un diamètre moyen de 5 angströms (5 x 10-10 m). Ces espaces sont assez grands pour inclure la chaîne linéaire ou ramifiée rarement composés dans le réseau cristallin, mais trop petits pour des structures très ramifiés ou cycliques. Ainsi, les structures de cette dernière sont exclus. Les cristaux peuvent ensuite être lavées, et les structures hautement ramifiés ou cycliques peuvent être retirés de l’échantillon. Dissolution subséquente du cristal libère les composés droit-enchaînée et rarement ramifiée dans la solution, d'où ils peuvent être extraits et analysés.
Figure 2. Représentation de la structure chimique et cristalline de l’urée. (de www.imgkid.com) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Adduction de l’urée est une technique qui sépare les alkénones droit-enchaînée de composés hautement ramifiés et cycliques.
L’urée est un composé organique qui forme une structure cristalline poreuse. Le cristal peut piéger certaines molécules, formant un adduit, tandis que d’autres ne peuvent pas s’adapter au sein de la structure.
Adduction de l’urée utilise les différentes tailles et formes de composés pour les séparer – similaire à la façon dont une pièce de monnaie compteuse va trier un pot de pièces de monnaie.
Cette vidéo fait partie d’une série sur les lipides extraction, purification et analyse des sédiments. Il illustrera l’utilisation de l’adduction d’urée pour effectuer la purification d’exclusion de taille sur un échantillon d’alcénone paleothermometry.
Adduction de l’urée est une méthode de purification fondée sur l’exclusion de taille. Il sépare de composés droit-enchaînée ou rarement ramifiée – tels que les n-alcanes et alkénones - de ceux qui sont hautement ramifiés ou cycliques.
Ceci est possible en raison de la structure cristalline particulière de l’urée. Quand une formes cristallines d’urée, minuscules espaces sont créés entre les molécules individuelles. Ces espaces sont longues et étroites - donc à chaîne droite ou ramifiée rarement composés peuvent s’insérer dans le réseau cristallin, tandis que les composés hautement ramifiés et cycliques sont trop grands.
Les cristaux d’urée sont ensuite lavées avec un solvant apolaire, sépare les molécules exclus ceux linéaire inclus. Les molécules lavés peuvent être extraits et analysés directement, tandis que les cristaux doivent être dissous dans l’eau pour libérer les linéaires composés en solution d’abord. Un autre solvant apolaire est ensuite utilisé pour extraire les composés désirées de l’eau.
Les deux molécules inclus et exclus peuvent fournir des informations précieuses. Par exemple, très ramifiée isoprénoïdes, produites par les diatomées de glace de mer, peut être un proxy pour l’existence de la banquise saisonnière aux latitudes élevées. Composés cycliques peuvent refléter la présence de feux passés. Droit enchaînée alcanes et alkénones sont des proxys communs pour la température de surface écosystème structure et de la mer.
La purification fournie par adduction d’urée n’est pas toujours nécessaire, car certains composés d’intérêt peuvent être analysés directement à partir de l’échantillon biologique extrait inaltéré. Dans les cas extrêmes - tels que dans les sédiments acquis de zones fortement polluées, comme les estuaires, près de centres industriels - une adduction de l’urée peut être nécessaire d’enlever des composés inconnus qui élués pendant l’analyse.
Maintenant que vous comprenez l’adduction de l’urée, vous êtes prêt à commencer la procédure.
Pour commencer, acquérir un extrait lipidique total séchés – ou TLE – qui a été extrait de l’échantillon et épuré par saponification et colonne de chromatographie.
Préparer ensuite, à l’urée, adduction solutions énoncées dans le protocole du texte. S’assurer que tous les composants sont pure et libre d’hydrocarbures.
Suspendre l’échantillon dans 1,5 mL de la solution de DCM/hexane. Si l’ELT ne se dissout pas complètement, laisser agir pendant 5 min. Ajouter 1,5 mL de la solution d’urée et de méthanol. Regardez pour la formation d’un précipité blanc, comme c’est le signal la création de cristaux d’urée. Ensuite, séchez doucement les cristaux d’urée sous atmosphère d’azote, à l’aide de la chaleur douce. N’oubliez pas de s’évaporer tout du solvant. Une fois que les cristaux sont complètement séchés, les rincer 3 fois à environ 1 mL d’hexane. Utiliser une pipette de verre pour enlever l’hexane entre chaque rinçage et transférer dans un nouveau flacon. Ils sont repérés les « non-adduit ». Ensuite, dissoudre les cristaux dans 2 mL d’eau pure. Secouer pour assurer une dissolution complète.
Pour extraire les biomarqueurs de l’eau supplémentaire, ajouter 1 mL d’hexane, bouchon et agiter doucement pendant 5 s.
Laisser la solution se reposer jusqu'à ce que l’hexane et eau sépareront complètement. Puis, à l’aide d’une pipette en verre, retirer environ 75 % de l’hexane et le transférer dans un nouveau flacon. Ils sont repérés les « adduit ».
Répétez ce procédé d’extraction en deux fois, ajouter 1 mL d’hexane chaque fois. Combiner les trois adduits dans un flacon. Jeter la solution d’eau et de l’urée dans un conteneur à déchets approprié. L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse.
Adduction de l’urée a plusieurs applications dans la séparation et la purification de molécules organiques.
Un isotope est une variante d’un élément chimique qui diffère de la quantité de neutrons et donc se distingue par sa masse atomique. Un élément peut avoir plusieurs isotopes, chacune ayant une masse différente. Isotopes peuvent également avoir des propriétés chimiques et moléculaires qui diffèrent d’un de l’autre, ainsi il peut être important de déterminer quels isotopes sont présents dans un échantillon donné. Dans cet exemple, les rapports isotopiques de carbone et d’hydrogène dans les cires de feuilles ont été mesurées afin de recueillir des informations sur les voies métaboliques de la plante. Très grandes quantités de matériel sont nécessaires pour déterminer les rapports des isotopes et composés ayant des détections semblables à de faibles concentrations peuvent se chevaucher si grandes quantités sont analysées.
Donc, adduction de l’urée a été utilisée pour séparer les n-alcanes d’intérêt du tout composés interférents. Retirer ces matières indésirables prévues un rapport isotopique précise à déterminer.
Le pétrole est un mélange complexe d’hydrocarbures, chacune avec des usages et des propriétés uniques. La séparation de ces composés du pétrole est très importante dans l’industrie chimique - alcanes ramifiés sont souvent utilisés comme lubrifiants légers, tandis que les alcanes à chaîne droite sont principalement utilisés dans les processus d’alkylation. Dans cet exemple, adduction de l’urée a été utilisée pour séparer des alcanes de kérosène. À l’aide d’une série successive d’adductions d’urée, ces alcanes ont été séparés de kérosène à une pureté de 99-pourcentage.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la purification de mélanges organiques complexes via l’adduction de l’urée. Vous devez maintenant comprendre exclusion de taille, l’importance de la purification des échantillons de composant exacte mesure et adduction de l’urée.
Merci de regarder !
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. le programme d’installation et préparation du matériel
- Obtenir un lipide total extrait (TLE) en utilisant une méthode d’extraction par solvant (Sonication, Soxhlet ou Accelerated Solvent Extraction (ASE)).
- Acheter les matériaux suivants de n’importe quel détaillant de produits chimique : tible borosilicate verre pipettes et ampoules ; eau pure ; hexane ; Dichlorométhane (DCM) ; méthanol ; urée.
- Les réactifs doivent être pure et libre à partir d’hydrocarbures. Par ailleurs, l’eau pure peut être faite dans un laboratoire à l’aide d’un système de purification de l’eau.
- Obtenir des flacons de verre de borosilicate de 4 mL avec bouchons bordées de PTFE.
2. méthodes
- Faire un mélange de 2:1 DCM:Hexane (v : v).
- Dans un erlenmeyer, mélanger 200 mL de DCM et 100 mL d’hexane.
- Faire un mélange d’urée dans le méthanol (100 mg/mL).
- Verser 300 mL de méthanol dans un erlenmeyer.
- Ajouter 300 mg d’urée.
- Remuer sur une plaque automatique remuer jusqu'à dissolution complète de l’urée.
- Commencez par l’échantillon sec dans un flacon de 4 mL.
- Suspendre l’échantillon dans 1,5 mL d’un mélange de 2:1 de DCM:Hexane (v : v).
- Si l’échantillon ne se dissout pas complètement, laisser agir pendant 5 min.
- À ce mélange, ajouter 1,5 mL d’urée dans le méthanol.
- Après cet ajout, guettez un précipité blanc de forme. Ceci signale la création de cristaux d’urée.
- Sécher doucement les cristaux sous atmosphère d’azote, à l’aide de la chaleur douce. S’assurer que tous les solvant s’est évaporée avant de passer à l’étape suivante.
- Rincer les cristaux 3 x avec environ 1 mL d’hexane. Supprimer l’hexane entre chaque rinçage à l’aide d’une pipette de verre pour le transférer dans un flacon étiqueté « non-adduit. »
- Dissoudre les cristaux dans 2 mL d’eau pure. Secouer pour assurer une dissolution complète.
- Extraire la phase aqueuse avec de l’hexane en ajoutant 1 mL et en secouant doucement pendant 5 s.
- Permettre à l’hexane et eau à complètement séparés avant d’enlever environ 75 % de l’hexane à l’aide d’une pipette de verre et de le transférer dans un flacon étiqueté « adduit. »
- Répétez l’étape 2.10 deux fois.
- Jeter la solution d’eau et de l’urée dans un conteneur à déchets approprié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Cette technique de purification produit deux flacons différents ; un étiqueté adduit, contenant des composés du droit-enchaînée et rarement ramifiée, et une autre intitulée non-adduit, contenant des composés hautement ramifiés et cycliques. Cette procédure a diminué considérablement la complexité d’un échantillon à analyser sur un instrument. Cette diminution de la complexité est souvent cruciale pour l’analyse précise de composés cibles. Par exemple, dans les milieux littoraux après environ 1850, alkénones éluer conjointement avec des composés gênants, ostensiblement les polluants mis en place après la révolution industrielle, qui ne sont pas supprimés à l’aide de la chromatographie sur colonne ou saponification seule. Apparemment, les polluants sont cycliques ou ramifiées car adduction urée retire de l’échantillon. Haut 160 ans de certains de ces archives de sédiments peut être analysé en toute confiance pour Uk'37 seulement en raison de l’application de l’adduction de l’urée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Adduction de l’urée est souvent utilisée dans la purification des n-alcanes, constituants communs de cire des feuilles, afin d’éliminer l’élution des composés avant l’analyse isotopique. Les rapports isotopiques de carbone et d’hydrogène de cires des feuilles chez les plantes contiennent des informations sur les voies métaboliques et les conditions environnementales, la plante utilisée et a vécu dans, respectivement. Afin de déterminer les rapports isotopiques, une grande quantité du composé doit être chargée sur un GC. Ces grandes quantités provoquent souvent des composés qui éluent proches l’un de l’autre à des concentrations plus faibles pour éluer conjointement. Souvent, les composés d’élution conjointement avec des alcanes sont ramifiées ou cycliques des portions de cet alcane et peuvent donc être supprimés à l’aide d’adduction de l’urée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
