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Identificação de Roedores II

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Identificação de Roedores II

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Os registros de animais devem ser mantidos com precisão para garantir que a coleta de dados esteja correta. Os registros vão desde a manutenção de informações sobre cartões de gaiola até a ter um banco de dados detalhado com todas as informações relevantes sobre cada animal. O principal componente da manutenção dos registros é a identificação individual dos animais de pesquisa. Existem uma variedade de métodos adequados para identificar ratos e ratos. Este vídeo descreve as técnicas processuais para tatuagem, colocação de microchips e métodos temporários de identificação, e também explora os benefícios de cada um.

Principles

O uso da tatuagem de cauda é benéfico em muitos protocolos de pesquisa. Tatuagens de cauda são ideais para um animal que deve ser imagedo em uma máquina de ressonância magnética, ou que é geneticamente predisposto à dermatite ulcerativa. Para identificação rápida de um animal em uma gaiola, sem ter que contê-lo, a tatuagem da cauda é facilmente visualizada. No entanto, essa técnica requer habilidade, prática e mão firme; equipamentos especializados também são necessários. ¹

Protocolos experimentais podem exigir a genotipagem de recém-nascidos já no primeiro dia. Como resultado, é essencial que esses filhotes sejam permanentemente identificados. Nesta idade jovem, o pinnae da orelha não é desenvolvido o suficiente para inserir uma etiqueta de ouvido, e um soco de ouvido ainda não pode ser usado neles. No passado, era comum um pesquisador usar um código de remoção de dedos para identificar recém-nascidos. No entanto, isso foi estressante tanto para o animal jovem quanto para a represa, e, portanto, tem sido considerado desumano. ² O uso da tatuagem dos dedos permite que os animais sejam permanentemente identificados até que sejam grandes o suficiente para marcação de ouvido ou socos na orelha. ³

Embora o processo de implantação de um microchip seja relativamente fácil, existem vários fatores que limitam sua utilidade para identificação em camundongos. Os microchips estéreis são do tamanho de um grande grão de arroz, e requerem uma agulha de calibre 10 a 12 para entrega. Assim, eles são muito grandes para um rato. O custo dos microchips e do dispositivo de leitura também pode ser proibitivo, já que a vida útil do mouse é curta e o número de animais geralmente é extenso. Animais destinados a serem imagens em uma máquina de ressonância magnética não podem ter implantes neles. No entanto, se houver um grupo de animais valiosos que devem ser identificados permanentemente, microchips podem ser usados. ⁴

Estudos agudos que requerem que os animais sejam identificados por horas, ou alguns dias, não necessitam do uso de identificação permanente. Marcadores não toxicológicos são feitos especificamente para colorir a pele dos animais, e estão disponíveis em várias cores. Estes corantes marcadores podem permanecer visíveis por várias semanas. Os marcadores também podem ser usados em conjunto com outros métodos para identificar facilmente animais específicos em um grupo.

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Procedure

1. Tatuagem de cauda

Tatuagens de cauda são facilmente lidas sem a necessidade de lidar com o animal.

Figura 1. Tatuagem de cauda em ratos adultos

Prepare o equipamento de tatuagem de acordo com as instruções do fabricante. Uma pequena quantidade de tinta é necessária. O corante preto deve ser usado para ratos ou ratos albinos, e corante verde para ratos pigmentados ou ratos.
Prepare os animais para identificação.
NOTA: Para minimizar a apreensão ou angústia, a tatuagem da cauda deve ser realizada em uma sala de procedimento e não em uma área de alojamento animal.
1. Contenha adequadamente o animal para tatuagem para que o movimento seja mínimo.
2. Ratos desmaseamento são contidos usando um copo com entalhe plástico, com o lábio do copo preso sob os parafusos na plataforma de tatuagem, e a cauda estendendo-se através do entalhe.
3. Ratos adultos podem ser contidos por meio de um contidor de copo, com a cauda arrancada da abertura e a flange do copo mantida no lugar através de uma plataforma ou outro dispositivo.
4. Limpe a cauda com uma pequena quantidade de limpador de tecido diluído aplicado com um cotonete de ponta de algodão. Ratos adultos geralmente têm um acúmulo de escala e detritos na cauda que devem ser limpos antes de aplicar a tatuagem. Um esfoliante de água e sabão da cauda removerá a maior parte da sujeira e detritos. Seque bem a cauda antes de prosseguir.
5. Aplique óleo de tecido na pele com um cotonete de ponta de algodão pouco antes da tatuagem. O óleo de tecido é necessário para minimizar os danos teciduais, amaciando a pele e lubrificando a agulha da tatuagem. Além disso, o óleo dissolve qualquer sujeira não removida pelo processo de limpeza e evita a coloração de tinta da pele nontattooed.
Aplique a tatuagem.
1. Mergulhe a ponta da agulha no pigmento com a máquina desligada.
2. Leve a ponta da agulha para o local da tatuagem com a arma ativada pelo pedal do pé.
3. Faça curto, até mesmo golpes em uma direção. Numerais e letras devem ser tatuados de tal forma para que sejam construídos em segmentos com ângulos e curvas mínimos (quando possível).
4. Penetre profundamente na dermis com a agulha para deposição permanente de pigmento. Uma mudança no som da agulha ativada pode ajudar a discernir a profundidade.
5. Aproxime-se da pele com a agulha em um ângulo de 90^o para deposição adequada do pigmento.
Limpeza e cuidado pós-tatuagem
1. Borrida (não limpe) a tatuagem completa do excesso de pigmento com uma toalha de papel.
2. A presença de sangue na tatuagem ou na toalha de papel indica que a tatuagem foi feita muito profunda e, portanto, é improvável que seja permanente.
3. Reforce áreas finas de personagens de tatuagem com pigmento adicional. Os caracteres são reforçados com pigmento depositado paralelamente, mas não em cima do pigmento já depositado.
4. Para adicionar pigmento adicional, mergulhe a ponta da agulha no reservatório de corante para cada dois caracteres para ratos e cada caractere para ratos.
5. As razões para desbotar tatuagens incluem quantidades inadequadas de pigmento, tatuagens feitas muito rasas, tatuagens feitas muito profundamente, um ângulo inapropriado da agulha para a pele, agulhas cegas ou fisadas sendo usadas, ou a tatuagem sendo feita muito rapidamente.
6. Limpe completamente o equipamento de tatuagem após cada uso de acordo com as instruções do fabricante.

2. Tatuagem de dedos dos recém-nascidos

Protocolos experimentais podem exigir a genotipagem de recém-nascidos já no primeiro dia, o que torna essencial que esses filhotes sejam permanentemente identificados. O uso de tatuagem dos dedos permite que os animais sejam identificados até que sejam grandes o suficiente para marcação de ouvido ou socos na orelha.

Figura 2. A técnica de contenção adequada para tatuar um rato de nénato. A lanceta tem o corante verde na ponta.

Contenha filhotes pré-filhotes.
1. Copo o recém-nascido na mão em uma almofada de gaze. Posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor o dedo do pé escolhido, ou os dedos dos pés, para a tatuagem.
2. Segure o pé perto dos dedo dos pés para que o dedo tenha uma superfície sólida atrás dele, impedindo que ele se dobre.
3. Não escamos a perna ao posicionar o pé. Filhotes que são contidos podem se mexer, mas nenhuma vocalização é necessariamente ouvida.
Prepare o equipamento.
1. Selecione uma lança-pedota animal Goldenrod de 4,5 mm.
2. Coloque um pequeno ponto de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa; a folha de alumínio funciona bem.
3. Mergulhe apenas a ponta da lanceta na pasta da tatuagem.
4. Use apenas uma pequena quantidade de pasta.
Aplique a tatuagem.
1. Cutuque o dedo desejado com a goldenrod lancet de acordo com um código de identificação.
2. Fure a pele para introduzir a pasta na pele, deixando uma marca.
3. Cutuque o mesmo local três vezes para garantir a penetração adequada.
4. Evite cutucar tão profundamente que o dedo do dedo sangra; isso pode resultar em uma tatuagem mais fraca.
Limpeza e cuidado pós-tatuagem
1. Limpe suavemente o local com uma limpeza absorvente/toalha para remover o excesso de pasta.
2. Não tente limpar o excesso de pasta do pé ou do corpo.
3. Devolva o animal para sua gaiola.
4. Quando os filhotes de enfermagem são tatuados, é aconselhável também tatuar a represa. Isso pode impedi-la de exagerar na pasta dos filhotes, o que pode levar ao uso excessivo da tatuagem.
5. Use uma lança lança-lança para cada ninhada.
6. As tatuagens devem ser verificadas no dia seguinte ao procedimento. Refaça a tatuagem se os pontos estiverem fracos ou não visíveis. Se os pontos forem visíveis no dia seguinte à tatuagem, eles devem permanecer visíveis durante a vida do animal.

3. Tatuagem dos dedo do dedo de ratos e ratos adultos

Quando uma ninhada de recém-nascidos é tatuada, sugere-se que a mãe também seja tatuada para que a pasta em seus filhotes não seja estranha a ela.

Contenção do animal.
1. Contenha o animal usando um cone de plástico ou um conterrmetro plexiglass que permite o acesso aos pés traseiros.
2. Estenda o pé do dispositivo de contenção.
3. Posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor o dedo do pé escolhido, ou os dedos dos pés, para a tatuagem
4. Segure o pé perto dos dedo dos pés para que o dedo tenha uma superfície sólida atrás dele, impedindo que o dedo do pé se dobre.
5. Não escamos a perna ao posicionar o pé. Adultos que são contidos podem tentar retirar o pé.
Prepare o equipamento.
1. Selecione uma lança-pedota animal Goldenrod de 5 mm.
2. Coloque um pequeno ponto de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa; a folha de alumínio funciona bem.
3. Mergulhe apenas a ponta da lanceta na pasta da tatuagem.
4. Use apenas uma pequena quantidade de pasta.
Aplique a tatuagem.
1. Cutuque o dedo desejado com a goldenrod lancet de acordo com um código de identificação.
2. Fure a pele para introduzir a pasta na pele, deixando uma marca.
3. Cutuque o mesmo local três vezes para garantir a penetração adequada.
4. Evite cutucar tão profundamente que o dedo do dedo sangra; isso pode resultar em uma tatuagem mais fraca.
Limpeza e cuidado pós-tatuagem
1. Limpe suavemente o local em uma limpeza absorvente/toalha para remover o excesso de pasta.
2. Não tente limpar o excesso de pasta do pé ou do corpo.
3. Devolva o animal para sua gaiola.
4. Use uma lança lança para cada animal.
5. As tatuagens devem ser verificadas no dia seguinte ao procedimento. Refaça a tatuagem se os pontos estiverem fracos ou não visíveis. Se os pontos forem visíveis no dia seguinte à tatuagem, eles devem permanecer visíveis durante a vida do animal.

4. Microchipagem

A implantação de um chip RFID é um método comumente utilizado para identificar animais.

Carregue o microchip no aplicador ou selecione uma seringa pré-carregada.
Contenha o animal usando um tubo de contenção plexiglass que permite a apreensão da pele sobre os ombros.
Tenda a pele, criando um bolso.
Coloque a agulha através da pele, bisbida para cima e paralelamente à coluna vertebral, e direcionou-a para a cauda.
Ejete o microchip subcutânea.
Retire a agulha e belisque a pele fechada no ponto de injeção. Isso impede que o microchip siga a agulha para fora da pele. Continue a pressionar para fornecer hemostasia para qualquer sangramento na pele.
Remova o animal do dispositivo de contenção e escaneie o chip para confirmar o código de identificação.

Figura 3. Colocação de microchip em ratos adultos.

5. Identificação temporária para camundongos

Corantes não ttóxicos e marcadores animais podem ser usados para identificação temporária de camundongos.

Contenha o mouse de tal forma que a área entre a escápula seja acessível para marcas na pele.
Coloque um marcador, ponto ou raia de corante na pele nesta área. Esta região é usada para evitar que o animal remova a marcação durante o preparo.
Verifique a marcação periodicamente se usá-la como único identificador por mais de alguns dias.
A cauda também pode ser usada por curtas durações. No entanto, o animal pode remover uma marca dele durante o preparo.

6. Identificação temporária para ratos

Contenha o rato para que a área para aplicação de corante ou marcador seja facilmente acessível. Em alguns casos, quando apenas uma listra ou ponto é necessário, o animal não precisará ser contido, mas é permitido se mover livremente na gaiola.
A contenção manual, agarrando a cauda e segurando-a esticada durante a aplicação da identificação, é comumente feita.
A imobilização temporária usando anestésicos inalatórios pode ser feita para animais fractious.
Verifique a marcação periodicamente se usar este método como o único identificador por mais de alguns dias.

A capacidade de identificar animais de pesquisa individuais é um aspecto essencial da manutenção de registros científicos e coleta de dados. A distinção entre os animais garante que o sujeito correto seja usado para o procedimento experimental pretendido.

Existem vários métodos permanentes e temporários que os cientistas usam para identificar animais de laboratório individuais. Neste vídeo, discutiremos métodos envolvendo a tatuagem da cauda de roedor adulto, dedos dos filhos e dos dedos adultos. Em seguida, abordaremos a técnica de colocação de microchips comumente realizada em ratos adultos, seguida pelo método de identificação temporária universal que utiliza corantes não tóxicos.

Antes de aprofundar os protocolos para esses métodos, vamos rever as considerações, benefícios e deficiências de cada uma dessas técnicas. A tatuagem de cauda é benéfica em muitos protocolos de pesquisa, como experimentos envolvendo imagens de ressonância magnética ou aqueles em que os animais são geneticamente predispostos a condições de pele, incluindo dermatite ulcerativa. Outra vantagem das tatuagens de cauda é que elas são facilmente visualizadas sem ter que conter manualmente o animal.

Certos protocolos experimentais requerem genotipagem de recém-nascidos já no primeiro dia, o que torna essencial que esses filhotes sejam permanentemente identificados. O uso da tatuagem dos dedos permite que esses animais sejam identificados até que sejam grandes o suficiente para marcação de ouvido ou socos na orelha. É uma boa ideia aplicar uma tatuagem semelhante ao dedo do pé na mãe adulta para evitar que ela reaja demais e pentee excessivamente a nova tatuagem de seu filhote. Embora existam várias vantagens em utilizar esse método, a desvantagem é que o procedimento requer habilidade, prática, mão firme e equipamentos especializados.

O próximo método de identificação permanente em consideração é a microchipagem. Embora, implantar microchips seja um processo relativamente fácil, existem vários fatores que limitam sua utilidade. Primeiro, esses chips são aproximadamente do tamanho de um grande grão de arroz e requerem uma agulha de calibre 10-12 para implantação, que é muito grande para um rato, limitando assim o método a ratos adultos. Em segundo lugar, os microchips são caros e, portanto, não são ideais para identificar um grande número de animais. Por fim, os microchips não podem ser usados nos experimentos envolvendo ressonância magnética. No entanto, se houver um grupo de animais valiosos como animais criadores com genética única que deve ser permanentemente identificada, microchips podem ser usados.

O último método que discutiremos é a identificação temporária usando marcadores não tóxicos. Os marcadores não tóxicos são feitos para colorir a pele dos animais de pesquisa. Este método é ideal para estudos de curto prazo que exigem que os animais sejam identificados por apenas algumas horas ou dias, embora os corantes possam permanecer visíveis por várias semanas. Alguns pesquisadores usam esses marcadores em conjunto com outros métodos de identificação para identificar facilmente animais específicos em um grupo.

Agora que discutimos o passado, vamos aprender os procedimentos, começando com a tatuagem de cauda. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos adultos, mas o mesmo pode ser aplicado para desmamar e ratos adultos.

Para minimizar qualquer apreensão ou angústia aos animais, a tatuagem da cauda deve ser realizada na sala de procedimento e não na área de alojamento animal. Antes de aplicar a tatuagem, contenha o mouse usando um minguante, com a cauda arrancada da abertura. A flange da taça é realizada no lugar através de uma plataforma de vidro especializada. Em seguida, limpe a cauda com uma pequena quantidade de limpador de tecido diluído em um cotonete com ponta de algodão. Este passo é importante para remover qualquer acúmulo de escala e detritos que possam interferir com a tatuagem. Em seguida, aplique óleo de tecido na pele da cauda com outro cotonete. Isso minimiza os danos teciduais, suavizando a pele e fornecendo lubrificação para a agulha da tatuagem. Além disso, o óleo dissolve a sujeira não removida pelo processo de limpeza e evita a coloração de tinta na pele não tatuada. Agora você está pronto para aplicar a tatuagem.

Enquanto a máquina está desligada, mergulhe a ponta da agulha da tatuagem, que é uma lança ou agulha hipodérmica, no pigmento. Em seguida, ative a arma usando o pedal do pé, coloque a ferramenta de tatuagem na cauda e leve a ponta da agulha para o local da tatuagem. Aproxime-se da pele com a agulha em um ângulo de 90° e penetre profundamente no ponto dermis de tal forma que o pigmento seja permanentemente depositado. Uma mudança no som da agulha ativada pode ajudar a discernir a profundidade. Faça curtos até traços em uma direção, formando numerais e letras. Tente usar curvas e ângulos mínimos ao aplicar a tatuagem.

Para adicionar pigmento adicional, mergulhe a ponta da agulha no reservatório de corante para cada um dos dois caracteres para ratos e cada caractere para ratos. Borrida a tatuagem completa com uma toalha de papel para remover o excesso de pigmento. A presença de sangue na tatuagem ou na toalha de papel indica que a tatuagem foi feita muito profunda e, portanto, é improvável que seja permanente. Reforce caracteres finos com pigmento adicional colocando a agulha paralela, não no topo, do pigmento já depositado. Limpe completamente o equipamento de tatuagem após cada uso, e uma agulha nova ou esterilizada e um suprimento fresco de tinta devem ser usados entre gaiolas para evitar a transmissão da doença.

Em seguida, aprenderemos como aplicar tatuagens de dedo do dedo em recém-nascidos e adultos. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos, mas os mesmos passos são aplicáveis para ratos.

Os recém-nascidos são tatuados em seus dedos, pois os ossos da cauda não são ossificados e o comprimento da cauda é muito pequeno. Também à medida que a cauda cresce, a pele seria esticada e os números podem ficar distorcidos, fracos e ilegíveis. Comece colocando um ponto de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa, como a folha de alumínio. Em seguida, copo o filhote pré-desmastado em sua mão usando uma almofada de gaze. Posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem. Segure o pé perto dos dedo dos pés para que o dedo do pé selecionado tenha uma superfície sólida atrás dele para evitar que ele se dobre.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 4,5 mm na pasta da tatuagem. Em seguida, cutuque o dedo desejado de acordo com o código pré-determinado. Para garantir a permeação adequada, cutuque o mesmo local três vezes. Penetre a pele o suficiente para que a pasta deixe uma marca, mas evite cutucar tão profundamente que o dedo do dedo sangra. Limpe suavemente a nova tatuagem com a gaze para remover qualquer excesso de pasta de tatuagem, e devolva o animal para sua gaiola. Use uma lança lança para a próxima ninhada. Um dia após o procedimento, verifique se a tatuagem é visível.

Quando os filhotes de enfermagem são tatuados, é aconselhável também tatuar a represa. Isso pode impedi-la de exagerar e pentear excessivamente as tatuagens de seu filhote. Para aplicar uma tatuagem do dedo do pé a um adulto, novamente, primeiro coloque um pequeno ponto de pasta de tatuagem verde em uma folha de alumínio. Em seguida, contenha o animal usando um cone de plástico ou um conterrmetro plexiglass que permite o acesso aos pés traseiros. Estenda o pé do dispositivo de contenção e posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 5 mm na pasta da tatuagem. E, como antes, aplique a tatuagem cutucando e perfurando a pele do dedo do dedo desejado pelo menos três vezes para garantir a penetração adequada. Em seguida, limpe suavemente a tatuagem para remover qualquer excesso de pasta, e devolva o animal para sua gaiola. Assim como os recém-nascidos, verifique a tatuagem um dia após o procedimento. Se a marca for visível no dia seguinte à tatuagem, ela deve permanecer visível durante a vida do animal. Se for fraco ou não visível, refaça a tatuagem como descrito anteriormente.

O próximo método de identificação que discutiremos envolve a implantação de microchips em roedores. O chip comumente usado para rotular animais de laboratório é um chip de identificação de radiofrequência, ou RFID. Normalmente, o chip é pré-carregado em agulhas, que podem então ser colocados no aplicador. Para inserção do chip, use um tubo plexiglass para conter o animal certificando-se de que você ainda pode agarrar a pele sobre os ombros. Primeiro, tenda a pele para criar um bolso. Em seguida, coloque a agulha através da pele, bisbida para cima, paralelamente à coluna vertebral, e direcionada em direção à cauda. Ejete o microchip subcutâneamente e retire a agulha. Aperte a pele fechada no local da injeção para evitar que o chip siga a agulha para fora da pele. Continue a pressionar para fornecer hemostasia para qualquer sangramento na pele. Remova o animal do dispositivo de contenção e escaneie o chip usando o leitor fornecido pela fabricante para confirmar o código de identificação.

Por fim, vamos aprender como aplicar corantes temporários aos roedores para identificação. Vamos começar com ratos. Primeiro, conter o animal de tal forma que a área entre as omoplatas seja acessível. Esta parte do corpo está a salvo de auto-preparação. Coloque um ponto ou raia do corante na pele nesta área e coloque o animal de volta em sua gaiola.

Para ratos, contenha o animal manualmente, agarrando a cauda e segurando-a esticada. Isso garante que a área para aplicação de corante seja facilmente acessível, que pode ser cabeça, ombros ou garupa. Coloque um ponto ou raia do corante na pele. Às vezes é possível aplicar corante não tóxico sem conter o animal. Verifique as marcas nesses animais periodicamente, especialmente se você estiver usando-os como o único identificador por mais de alguns dias.

Agora que revisamos os procedimentos desses diferentes métodos de identificação, vamos ver como os cientistas os estão usando em diferentes estudos de pesquisa hoje.

O uso de roedores em experimentos de comportamento é bastante comum. Aqui, os pesquisadores usaram a tatuagem da cauda para marcar os animais permanentemente e, em seguida, observaram-nos por vários dias em um ambiente artificialmente construído em casa-gaiola. Os dados coletados revelaram diferenças de comportamentos, como a distância movida, entre o controle e os animais experimentais, durante um período pós-cirurgia de 10 dias.

Em outro experimento de comportamento, os investigadores realizaram tatuagens de dedos em recém-nascidos e os colocaram em uma caixa de gravação com microfones especiais para gravar vocalizações ultrassônicas. O objetivo deste experimento foi olhar para as diferenças na taxa de chamada, que é o número de vocalizações por minuto, em camundongos selvagens e camundongos deficientes shank2 - um modelo de autismo -durante 12 dias de período neonatal e idade adulta.

Por fim, como discutido anteriormente, o uso de corante não tóxico é uma maneira eficiente de marcar animais para experimentos de curto prazo. Aqui, os cientistas estavam interessados na expressão transitória de uma proteína plasmática. Então eles marcaram os animais com marcadores temporários, injetaram o DNA plasmídeo por via intravenosa, e coletaram a amostra de sangue dois dias depois para determinar a expressão proteica usando a técnica de mancha ocidental.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à tatuagem, colocação de microchips e métodos temporários de identificação para ratos e ratos de laboratório. A identificação animal é um componente primário da manutenção de registros em pesquisas. Portanto, ao escolher o método de identificação adequado, muitos fatores devem ser deliberados. Isso inclui o nível de desconforto para o animal, a facilidade da técnica, as necessidades experimentais e, finalmente, o custo associado ao método. Como sempre, obrigado por assistir!

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Applications and Summary

Ao escolher o método de identificação adequado, muitos fatores devem ser deliberados. Cada técnica tem vantagens e desvantagens que devem ser consideradas em relação às necessidades experimentais. Embora os custos devem ser ponderados juntamente com outros fatores, a facilidade da técnica e o nível de desconforto para os animais devem ser as principais considerações. ^4,5

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References

Robinson, V., Morton, D.B., Anderson, D., Carver, J.F.A., Francis, R.J., Hubrecht, R., Jenkins, E., Mathers, K.E., Raymond, R., Rosewell, I., Wallace, J., and Wells, D.J. 2003. Refinement and reduction in production of genetically modified mice. Laboratory Animals. 37:S1-S50.
Schaefer, D.C., Asner, I.N., Seifert, B., Bürki, K., and Cinelli, P. 2010. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Laboratory Animals. 44:7-13
Castelhano-Carlos, M.J., Sousa, N., Ohl, F., and Baumans, V. 2010. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Laboratory Animals. 44: 88-103.
Danneman, P.J., Suckow, M.A., and Brayton, C.F. 2013. The laboratory mouse. Second edition. New York, NY: CRC Press.
Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.

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A capacidade de identificar animais de pesquisa individuais é um aspecto essencial da manutenção de registros científicos e coleta de dados. A distinção entre os animais garante que o sujeito correto seja usado para o procedimento experimental pretendido.

Existem vários métodos permanentes e temporários que os cientistas usam para identificar animais de laboratório individuais. Neste vídeo, discutiremos métodos envolvendo a tatuagem da cauda de roedor adulto, dedos dos filhos e dos dedos adultos. Em seguida, abordaremos a técnica de colocação de microchips comumente realizada em ratos adultos, seguida pelo método de identificação temporária universal que utiliza corantes não tóxicos.

Antes de aprofundar os protocolos para esses métodos, vamos rever as considerações, benefícios e deficiências de cada uma dessas técnicas. A tatuagem de cauda é benéfica em muitos protocolos de pesquisa, como experimentos envolvendo imagens de ressonância magnética ou aqueles em que os animais são geneticamente predispostos a condições de pele, incluindo dermatite ulcerativa. Outra vantagem das tatuagens de cauda é que elas são facilmente visualizadas sem ter que conter manualmente o animal.

Certos protocolos experimentais requerem genotipagem de recém-nascidos já no primeiro dia, o que torna essencial que esses filhotes sejam permanentemente identificados. O uso da tatuagem dos dedos permite que esses animais sejam identificados até que sejam grandes o suficiente para marcação de ouvido ou socos na orelha. É uma boa ideia aplicar uma tatuagem semelhante ao dedo do pé na mãe adulta para evitar que ela reaja demais e pentee excessivamente a nova tatuagem de seu filhote. Embora existam várias vantagens em utilizar esse método, a desvantagem é que o procedimento requer habilidade, prática, mão firme e equipamentos especializados.

O próximo método de identificação permanente em consideração é a microchipagem. Embora, implantar microchips seja um processo relativamente fácil, existem vários fatores que limitam sua utilidade. Primeiro, esses chips são aproximadamente do tamanho de um grande grão de arroz e requerem uma agulha de calibre 10-12 para implantação, que é muito grande para um rato, limitando assim o método a ratos adultos. Em segundo lugar, os microchips são caros e, portanto, não são ideais para identificar um grande número de animais. Por fim, os microchips não podem ser usados nos experimentos envolvendo ressonância magnética. No entanto, se houver um grupo de animais valiosos como animais criadores com genética única que deve ser permanentemente identificada, microchips podem ser usados.

O último método que discutiremos é a identificação temporária usando marcadores não tóxicos. Os marcadores não tóxicos são feitos para colorir a pele dos animais de pesquisa. Este método é ideal para estudos de curto prazo que exigem que os animais sejam identificados por apenas algumas horas ou dias, embora os corantes possam permanecer visíveis por várias semanas. Alguns pesquisadores usam esses marcadores em conjunto com outros métodos de identificação para identificar facilmente animais específicos em um grupo.

Agora que discutimos o passado, vamos aprender os procedimentos, começando com a tatuagem de cauda. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos adultos, mas o mesmo pode ser aplicado para desmamar e ratos adultos.

Para minimizar qualquer apreensão ou angústia aos animais, a tatuagem da cauda deve ser realizada na sala de procedimento e não na área de alojamento animal. Antes de aplicar a tatuagem, contenha o mouse usando um minguante, com a cauda arrancada da abertura. A flange da taça é realizada no lugar através de uma plataforma de vidro especializada. Em seguida, limpe a cauda com uma pequena quantidade de limpador de tecido diluído em um cotonete com ponta de algodão. Este passo é importante para remover qualquer acúmulo de escala e detritos que possam interferir com a tatuagem. Em seguida, aplique óleo de tecido na pele da cauda com outro cotonete. Isso minimiza os danos teciduais, suavizando a pele e fornecendo lubrificação para a agulha da tatuagem. Além disso, o óleo dissolve a sujeira não removida pelo processo de limpeza e evita a coloração de tinta na pele não tatuada. Agora você está pronto para aplicar a tatuagem.

Enquanto a máquina está desligada, mergulhe a ponta da agulha da tatuagem, que é uma lança ou agulha hipodérmica, no pigmento. Em seguida, ative a arma usando o pedal do pé, coloque a ferramenta de tatuagem na cauda e leve a ponta da agulha para o local da tatuagem. Aproxime-se da pele com a agulha em um ângulo de 90° e penetre profundamente no ponto dermis de tal forma que o pigmento seja permanentemente depositado. Uma mudança no som da agulha ativada pode ajudar a discernir a profundidade. Faça curtos até traços em uma direção, formando numerais e letras. Tente usar curvas e ângulos mínimos ao aplicar a tatuagem.

Para adicionar pigmento adicional, mergulhe a ponta da agulha no reservatório de corante para cada um dos dois caracteres para ratos e cada caractere para ratos. Borrida a tatuagem completa com uma toalha de papel para remover o excesso de pigmento. A presença de sangue na tatuagem ou na toalha de papel indica que a tatuagem foi feita muito profunda e, portanto, é improvável que seja permanente. Reforce caracteres finos com pigmento adicional colocando a agulha paralela, não no topo, do pigmento já depositado. Limpe completamente o equipamento de tatuagem após cada uso, e uma agulha nova ou esterilizada e um suprimento fresco de tinta devem ser usados entre gaiolas para evitar a transmissão da doença.

Em seguida, aprenderemos como aplicar tatuagens de dedo do dedo em recém-nascidos e adultos. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos, mas os mesmos passos são aplicáveis para ratos.

Os recém-nascidos são tatuados em seus dedos, pois os ossos da cauda não são ossificados e o comprimento da cauda é muito pequeno. Também à medida que a cauda cresce, a pele seria esticada e os números podem ficar distorcidos, fracos e ilegíveis. Comece colocando um ponto de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa, como a folha de alumínio. Em seguida, copo o filhote pré-desmastado em sua mão usando uma almofada de gaze. Posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem. Segure o pé perto dos dedo dos pés para que o dedo do pé selecionado tenha uma superfície sólida atrás dele para evitar que ele se dobre.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 4,5 mm na pasta da tatuagem. Em seguida, cutuque o dedo desejado de acordo com o código pré-determinado. Para garantir a permeação adequada, cutuque o mesmo local três vezes. Penetre a pele o suficiente para que a pasta deixe uma marca, mas evite cutucar tão profundamente que o dedo do dedo sangra. Limpe suavemente a nova tatuagem com a gaze para remover qualquer excesso de pasta de tatuagem, e devolva o animal para sua gaiola. Use uma lança lança para a próxima ninhada. Um dia após o procedimento, verifique se a tatuagem é visível.

Quando os filhotes de enfermagem são tatuados, é aconselhável também tatuar a represa. Isso pode impedi-la de exagerar e pentear excessivamente as tatuagens de seu filhote. Para aplicar uma tatuagem do dedo do pé a um adulto, novamente, primeiro coloque um pequeno ponto de pasta de tatuagem verde em uma folha de alumínio. Em seguida, contenha o animal usando um cone de plástico ou um conterrmetro plexiglass que permite o acesso aos pés traseiros. Estenda o pé do dispositivo de contenção e posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 5 mm na pasta da tatuagem. E, como antes, aplique a tatuagem cutucando e perfurando a pele do dedo do dedo desejado pelo menos três vezes para garantir a penetração adequada. Em seguida, limpe suavemente a tatuagem para remover qualquer excesso de pasta, e devolva o animal para sua gaiola. Assim como os recém-nascidos, verifique a tatuagem um dia após o procedimento. Se a marca for visível no dia seguinte à tatuagem, ela deve permanecer visível durante a vida do animal. Se for fraco ou não visível, refaça a tatuagem como descrito anteriormente.

O próximo método de identificação que discutiremos envolve a implantação de microchips em roedores. O chip comumente usado para rotular animais de laboratório é um chip de identificação de radiofrequência, ou RFID. Normalmente, o chip é pré-carregado em agulhas, que podem então ser colocados no aplicador. Para inserção do chip, use um tubo plexiglass para conter o animal certificando-se de que você ainda pode agarrar a pele sobre os ombros. Primeiro, tenda a pele para criar um bolso. Em seguida, coloque a agulha através da pele, bisbida para cima, paralelamente à coluna vertebral, e direcionada em direção à cauda. Ejete o microchip subcutâneamente e retire a agulha. Aperte a pele fechada no local da injeção para evitar que o chip siga a agulha para fora da pele. Continue a pressionar para fornecer hemostasia para qualquer sangramento na pele. Remova o animal do dispositivo de contenção e escaneie o chip usando o leitor fornecido pela fabricante para confirmar o código de identificação.

Por fim, vamos aprender como aplicar corantes temporários aos roedores para identificação. Vamos começar com ratos. Primeiro, conter o animal de tal forma que a área entre as omoplatas seja acessível. Esta parte do corpo está a salvo de auto-preparação. Coloque um ponto ou raia do corante na pele nesta área e coloque o animal de volta em sua gaiola.

Para ratos, contenha o animal manualmente, agarrando a cauda e segurando-a esticada. Isso garante que a área para aplicação de corante seja facilmente acessível, que pode ser cabeça, ombros ou garupa. Coloque um ponto ou raia do corante na pele. Às vezes é possível aplicar corante não tóxico sem conter o animal. Verifique as marcas nesses animais periodicamente, especialmente se você estiver usando-os como o único identificador por mais de alguns dias.

Agora que revisamos os procedimentos desses diferentes métodos de identificação, vamos ver como os cientistas os estão usando em diferentes estudos de pesquisa hoje.

O uso de roedores em experimentos de comportamento é bastante comum. Aqui, os pesquisadores usaram a tatuagem da cauda para marcar os animais permanentemente e, em seguida, observaram-nos por vários dias em um ambiente artificialmente construído em casa-gaiola. Os dados coletados revelaram diferenças de comportamentos, como a distância movida, entre o controle e os animais experimentais, durante um período pós-cirurgia de 10 dias.

Em outro experimento de comportamento, os investigadores realizaram tatuagens de dedos em recém-nascidos e os colocaram em uma caixa de gravação com microfones especiais para gravar vocalizações ultrassônicas. O objetivo deste experimento foi olhar para as diferenças na taxa de chamada, que é o número de vocalizações por minuto, em camundongos selvagens e camundongos deficientes shank2 - um modelo de autismo -durante 12 dias de período neonatal e idade adulta.

Por fim, como discutido anteriormente, o uso de corante não tóxico é uma maneira eficiente de marcar animais para experimentos de curto prazo. Aqui, os cientistas estavam interessados na expressão transitória de uma proteína plasmática. Então eles marcaram os animais com marcadores temporários, injetaram o DNA plasmídeo por via intravenosa, e coletaram a amostra de sangue dois dias depois para determinar a expressão proteica usando a técnica de mancha ocidental.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à tatuagem, colocação de microchips e métodos temporários de identificação para ratos e ratos de laboratório. A identificação animal é um componente primário da manutenção de registros em pesquisas. Portanto, ao escolher o método de identificação adequado, muitos fatores devem ser deliberados. Isso inclui o nível de desconforto para o animal, a facilidade da técnica, as necessidades experimentais e, finalmente, o custo associado ao método. Como sempre, obrigado por assistir!

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