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Environmental Microbiology

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Quantification de qPCR environnement microorganismes et virus à l’aide
 

Quantification de qPCR environnement microorganismes et virus à l’aide

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L’avènement de la PCR quantitative ou qPCR, a permis de déterminer quantitativement le montant de tout micro-organisme dans un échantillon environnemental.

Comme PCR standard, qPCR identifie des microorganismes en détectant la présence ou l’absence de séquences d’ADN spécifiques aux organismes d’intérêt. Cela permet une détection des microbes qui ne peuvent pas être cultivées en laboratoire, ce qui permet d’analyser une plus grande variété d’organismes environnementaux. En outre, qPCR permet la quantité d’ADN à évaluer quantitativement. Mais en même temps, des méthodes PCR détecter l’ADN de tous les organismes morts ou vivants, limitant la possibilité de chercher uniquement en croissance active des microbes dans l’échantillon.

Cette vidéo passera en revue les innovations chimiques qui distinguent qPCR PCR régulière, expliquer comment qPCR permet de mesurer quantitativement l’ADN, démontrer un protocole pour l’utilisation de qPCR pour détecter un virus à ARN d’échantillons de sol et enfin, montrer comment qPCR est appliquée à la microbiologie environnementale aujourd'hui.

Les principes de base derrière qPCR sont les mêmes que PCR régulière - répétée des cycles d’apprêt recuit au modèle, allongement du produit PCR et la dénaturation du produit de modèle, conduisant à l’exponentielle amplification d’une séquence cible des intérêts, connu comme l’amplicon, dans un ensemble de matériel de départ.

L’innovation de qPCR est dans l’ajout de produits chimiques fluorescents dans la réaction, ce qui permet la synthèse du produit PCR à chaque cycle à visualiser directement en « temps réel » par thermocycleurs spécialisés, permettant de quantifier la quantité de séquence de modèle dans l’échantillon original. La quantité est généralement mesurée en ce qui concerne le cycle seuil, abrégée Ct, également connu sous le nom du cycle de quantification ou Cq, qui correspond au cycle PCR à partir duquel la quantité de produits fluorescents dépasse le niveau de fond.

Quantification peut être relative, où la valeur det C d’une seule séquence est comparée à celle d’une autre séquence standard ou de contrôle ; la quantité relative est égale à deux élevé à la puissance de la différence de Ct. Sinon, si une série d’ADN de quantité connue est longent les échantillons dans la réaction, une courbe d’étalonnage en comparant la valeur de fluorescence à la quantité d’ADN peut être produite et permet à l’ADN de l’échantillon être dosée absolument.

Il existe deux grands types de molécules fluorescentes utilisées en qPCR. Dans un cas, des colorants fluorescents qui se lient spécifiquement à l’ADN bicaténaire est incluse dans la réaction. La teinture fluorescente uniquement lorsqu’elle est liée à l’ADN, permettant ainsi la quantité de produit ADN double-brin d’être dosée.

Dans l’autre méthode, une petite portion d’ADN, connu comme une sonde, est conçue contre une séquence cible spécifique d’intérêt. La sonde est liée chimiquement à un colorant fluorescent, mais aussi une molécule « extincteur » qui supprime le signal de fluorescence de la teinture quand à proximité. L’enzyme polymérase, qui synthétise le produit de l’ADN, a une activité capables de dégrader l’ADN qui causerait la molécule fluorescente « sortir » de la sonde, donc qui la sépare de la teinture de l’extincteur et permettant de détecter le signal de fluorescence.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la qPCR, regardons un protocole pour l’utilisation de cette technique permet d’identifier un virus à ARN qui infecte les plantes, le virus doux de marbrure de poivre, d’échantillons de sol.

Dans cette démonstration, échantillon sera prélevé de la rhizosphère, la zone de sol environ 7 mm autour des racines des plantes qui est influencée par les racines et les micro-organismes symbiotiques.

Pour recueillir la rhizosphère, tout d’abord soigneusement extrait de la plante d’intérêt par rapport au sol et frappez-le à supprimer comme beaucoup excédent du sol que possible. L’usine pour un traitement ultérieur dans le laboratoire de l’emballage.

Après avoir porté les échantillons au laboratoire, utilisez une spatule stérile à la ferraille le sol souhaité dans un récipient de collecte. Ensuite, recueillir le virus dans le sol et extraire l’ARN.

Une fois l’échantillon prélevé RNA, convertir en complémentaire ou ADNc par transcription inverse. Veuillez vous référer à la SciEd JoVE vidéo sur reverse transcription-PCR pour plus de détails de cette procédure.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer le qPCR, décongeler les réactifs congelés à la température ambiante à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire dédié et mettre sur la glace une fois décongelé. Composants de réactif contenant l’enzyme ADN polymérase doivent toujours être bien sur la glace.

Décongeler le cDNA de l’échantillon et un témoin positif ADN, tel qu’un morceau circulaire d’ADN appelée un plasmide qui a l’amplicon d’intérêt cloné dedans.

Avant d’assembler les réactions dans une plaque à 96 puits qPCR, préparer un modèle de tableau de 96 cellules sur papier et étiquette chaque cellule avec la réaction qui sera chargée dans la plaque. Comprendre les réactions pour chaque échantillon et de la norme en trois exemplaires, ainsi que pour le contrôle positif et un témoin négatif, comme par exemple une réaction non-ADN.

Calculer les volumes de réactifs nécessaires à une réaction « master mix », qui comprend tous les réactifs qui sont constants parmi les réactions. Préparer suffisamment mélange principal pour les réactions en triple pour tous les échantillons plus de contrôles et une majoration de 10 % pour tenir compte de l’erreur de pipettage.

Une fois que les réactifs sont décongelés, assembler le mélange maître dans un tube à centrifuger de 1,5 mL basse-adsorption. Pour ce faire, vortex brièvement chaque réactif à mélanger soigneusement, recueillir tout liquide sur le côté les tubes à l’aide d’une centrifugeuse mini et Pipeter le réactif dans le tube à centrifuger. N’oubliez pas d’utiliser de nouvelles pointes de pipette pour chaque composant de la réaction. Après tous les réactifs ont été ajoutés, vortex pour mélanger et centrifuger. Puis, partie aliquote la quantité appropriée de mélange principal dans les puits désignés sur la plaque de la PCR.

Ensuite, vortex et centrifuger chaque tube échantillon et contrôle ADN et Pipeter le montant approprié dans les puits respectifs sur la plaque de la PCR. Une fois que les échantillons ont été ajoutés, sceller la plaque avec une feuille d’étanchéité et utiliser l’outil étanchéité à pleinement s’aplatir le sceau et faire sortir les bulles d’air. Déchirez soigneusement les onglets non adhésifs aux extrémités du joint.

Pour collecter complètement le mélange réactionnel dans le fond des puits, placer la plaque dans une centrifugeuse avec un porte-plaque et d’équilibrer correctement le rotor avec une plaque de contrepoids. Impulsion-centrifugeuse la plaque jusqu'à 1 000 tr/min, puis laissez la centrifugeuse lentement s’arrête sans freins.

Placer la plaque de réaction dans la machine de qPCR. Configurer le programme PCR selon les spécifications du constructeur, réglage de la température de fusion selon la paire d’amorces utilisée. Définir le programme de réaction à exécuter.

Une fois que le programme de qPCR est terminé, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du contrôle positif pour calculer la quantité de l’ADNc dans chaque réaction. La quantité de virus dans l’échantillon initial peut ensuite être calculée.

Une fois que le programme de qPCR est terminé, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du contrôle positif pour calculer la quantité de l’ADNc dans chaque réaction.

Avec les résultats de la qPCR, le volume transféré dans les puits, l’extraction du sol et le facteur de la transcriptase inverse, le nombre de virus dans l’échantillon initial du sol peut être calculé.

Maintenant que vous savez comment qPCR est effectué, nous allons étudier comment il peut être utilisé pour analyser des échantillons environnementaux différents.

qPCR permet de quantifier la quantité de virus provenant de nombreux types d’échantillons. Dans cette application, deux types différents d’adénovirus étaient concentrés provenant d’échantillons de l’eau par un certain nombre de différentes méthodes. ADN a été ensuite extraite des virus et soumis à qPCR, afin d’évaluer l’efficacité relative des méthodes de concentration.

Une autre application pour dénombrement microbien qPCR-basé est de quantifier la concentration bactérienne dans les aliments et les échantillons agricoles - dans cet exemple, fécal et échantillons provenant des élevages de poulets de la litière. Plutôt que de cibler les espèces individuelles, les scientifiques ont effectué qPCR en utilisant des amorces contre un gène hautement conservé dans toutes les bactéries et quantifié la communauté bactérienne totale trouvée dans les échantillons.

Enfin, comme mentionné précédemment, l’un des inconvénients de la méthodologie traditionnelle qPCR est que les microbes vivants et morts ne peuvent être distingués. Cependant, en ajoutant un produit chimique appelé propidium monoazide ou PMA, qui ne peut entrer des cellules mortes, où il se lie à l’ADN pour inhiber les réactions enzymatiques comme la PCR, chercheurs ici étaient capables de distinguer entre les cultures vivantes et mortes d’e. coli O157 : H7, une souche pathogène commune trouvée dans l’eau et les aliments contaminés.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la quantification des microorganismes environnementales et les virus à l’aide de qPCR. Vous devez maintenant comprendre comment fonctionne le qPCR, comment utiliser qPCR pour mesurer la quantité d’un microbe dans un échantillon environnemental et certaines applications de cette technique. Merci de regarder !

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