Overview
Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia
Le curve di calibrazione vengono utilizzate per comprendere la risposta strumentale a un analita e prevedere la concentrazione in un campione sconosciuto. Generalmente, una serie di campioni standard viene effettuata a varie concentrazioni con un intervallo che include l'incognita di interesse e viene registrata la risposta strumentale a ciascuna concentrazione. Per una maggiore precisione e per comprendere l'errore, la risposta ad ogni concentrazione può essere ripetuta in modo da ottenere una barra di errore. I dati sono quindi dotati di una funzione in modo da poter prevedere concentrazioni sconosciute. In genere la risposta è lineare, tuttavia, una curva può essere fatta con altre funzioni purché la funzione sia nota. La curva di calibrazione può essere utilizzata per calcolare il limite di rilevazione e il limite di quantificazione.
Quando si realizzano soluzioni per una curva di calibrazione, ogni soluzione può essere realizzata separatamente. Tuttavia, ciò può richiedere molto materiale di partenza e richiedere molto tempo. Un altro metodo per fare molte concentrazioni diverse di una soluzione è quello di utilizzare diluizioni seriali. Con le diluizioni seriali, un campione concentrato viene diluito in modo graduale per produrre concentrazioni più basse. Il campione successivo viene ricavato dalla diluizione precedente e il fattore di diluizione viene spesso mantenuto costante. Il vantaggio è che è necessaria una sola soluzione iniziale. Lo svantaggio è che eventuali errori nella creazione di soluzioni - pipettaggio, massa, ecc. - vengono propagati man mano che vengono apportate più soluzioni. Pertanto, è necessario prestare attenzione quando si effettua la soluzione iniziale.
Principles
Le curve di calibrazione possono essere utilizzate per prevedere la concentrazione di un campione sconosciuto. Per essere completamente accurati, i campioni standard devono essere eseguiti nella stessa matrice del campione sconosciuto. Una matrice di campione è costituita dai componenti del campione diversi dall'analita di interesse, compreso il solvente e tutti i sali, le proteine, gli ioni metallici, ecc. che potrebbero essere presenti nel campione. In pratica, l'esecuzione di campioni di calibrazione nella stessa matrice dell'ignoto è talvolta difficile, poiché il campione sconosciuto può essere proveniente da un campione biologico o ambientale complesso. Pertanto, molte curve di calibrazione sono fatte in una matrice di campione che si avvicina strettamente al campione reale, come il liquido spinale cerebrale artificiale o l'urina artificiale, ma potrebbe non essere esatta. L'intervallo di concentrazioni della curva di taratura dovrebbe essere compreso tra parentesi quello nel campione sconosciuto previsto. Idealmente vengono misurate alcune concentrazioni al di sopra e al di sotto del campione di concentrazione previsto.
Molte curve di calibrazione sono lineari e possono essere adattate all'equazione di base y = mx + b, dove m è la pendenza e b è l'intercetta y. Tuttavia, non tutte le curve sono lineari e talvolta per ottenere una linea, uno o entrambi gli assi saranno su una scala logaritmica. La regressione lineare viene in genere eseguita utilizzando un programma per computer e il metodo più comune è quello di utilizzare un raccordo ai minimi quadrati. Con un'analisi di regressione lineare, viene dato un valore R2, chiamato coefficiente di determinazione. Per una semplice regressione singola, R2 è il quadrato del coefficiente di correlazione (r) e fornisce informazioni sulla distanza dei valori y dalla linea prevista. Una linea perfetta avrebbe un valore R2 di 1 e la maggior parte dei valori R2 per le curve di calibrazione sono superiori a 0,95. Quando la curva di calibrazione è lineare, la pendenza è una misura di sensibilità: quanto cambia il segnale per un cambiamento di concentrazione. Una linea più ripida con una pendenza maggiore indica una misurazione più sensibile. Una curva di calibrazione può anche aiutare a definire l'intervallo lineare, l'intervallo di concentrazioni che lo strumento fornisce una risposta lineare. Al di fuori di questo intervallo, la risposta può assottigliarsi a causa di considerazioni strumentali e l'equazione della calibrazione non può essere utilizzata. Questo è noto come il limite della linearità.
Il limite di rilevamento è la quantità più bassa che può essere determinata statisticamente dal rumore. Generalmente questo è definito come un segnale che è 3 volte il rumore. Il limite di rilevamento può essere calcolato dalla pendenza della curva di taratura ed è generalmente definito come LOD=3*S.D./m, dove S.D. è la deviazione standard del rumore. Il rumore viene misurato prendendo la deviazione standard di più misurazioni. In alternativa, in una traccia, il rumore può essere stimato come deviazione standard della linea di base. Il limite di quantificazione è la quantità che può essere differenziata tra i campioni ed è solitamente definita come 10 volte il rumore.
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Procedure
1. Fare gli standard: diluizioni seriali
- Crea una soluzione stock concentrata dello standard. Tipicamente, il composto viene accuratamente pesato e quindi trasferito quantitativamente in un pallone volumetrico. Aggiungere un po 'di solvente, mescolare in modo che il campione si dissolva, quindi riempire fino alla linea con il solvente appropriato.
- Eseguire diluizioni seriali. Prendere un altro matraccio volumetrico e pipettare la quantità di standard necessaria per la diluizione, quindi riempire fino alla linea con solvente e mescolare. In genere viene effettuata una diluizione di dieci volte, quindi per un pallone volumetrico da 10 ml, aggiungere 1 mL della diluizione precedente.
- Continuare se necessario per ulteriori diluizioni, pipettare dalla soluzione precedente per diluirla per fare il campione successivo. Per una buona curva di calibrazione, sono necessarie almeno 5 concentrazioni.
2. Eseguire i campioni per la curva di calibrazione e l'ignoto
- Eseguire i campioni con lo spettrofotometro UV-Vis per determinare la risposta strumentale necessaria per la curva di calibrazione.
- Prendi la lettura con il primo campione. È una buona idea eseguire i campioni in ordine casuale(cioè non dal più alto al più basso o dal più basso al più alto) nel caso in cui ci siano errori sistematici. Per ottenere una stima del rumore, ripetere la lettura su un dato campione 3-5x.
- Eseguire i campioni standard aggiuntivi, ripetendo le misurazioni per ciascun campione per ottenere una stima del rumore. Registrare i dati per creare un grafico in un secondo momento.
- Eseguire i campioni sconosciuti. Utilizzare condizioni il più possibile simili all'esecuzione degli standard. Pertanto, la matrice del campione o il tampone dovrebbero essere gli stessi, il pH dovrebbe essere lo stesso e la concentrazione dovrebbe essere nell'intervallo degli standard eseguiti.
3. Creazione della curva di calibrazione
- Registra i dati in un foglio di calcolo e utilizza un programma per computer per tracciare i dati rispetto alla concentrazione. Se sono state effettuate almeno misurazioni triplicate per ciascun punto, è possibile tracciare barre di errore della deviazione standard di tali misurazioni per stimare l'errore di ciascun punto. Per alcune curve, potrebbe essere necessario tracciare i dati con un asse come registro per ottenere una linea. L'equazione che governa la curva di calibrazione è generalmente nota in anticipo, quindi un log-plot viene utilizzato quando c'è un log nell'equazione.
- Esaminate la curva di calibrazione. Sembra lineare? Ha una porzione che sembra non lineare(cioè ha raggiunto il limite della risposta strumentale)? Per verificare, adattare tutti i dati a una regressione lineare utilizzando il software. Se il coefficiente di determinazione (R2) non è elevato, rimuovere alcuni dei punti all'inizio o alla fine della curva che non sembrano adattarsi alla linea ed eseguire nuovamente la regressione lineare. Non è accettabile rimuovere i punti nel mezzo solo perché hanno una grande barra di errore. Da questa analisi, decidi quale porzione della curva è lineare.
- L'output della lineare dovrebbe essere un'equazione del formato y=mx+b, dove m è la pendenza e b è l'intercetta y. Le unità per la pendenza sono l'unità/concentrazione dell'asse y, in questo esempio (Figura 1) assorbanza/μM. Le unità per l'intercetta y sono le unità dell'asse y. Si ottiene un coefficiente di determinazione (R2). Più alta è la R2, migliore è la vestibilità; una vestibilità perfetta dà un R2 di 1. Il programma può anche essere in grado di fornire una stima dell'errore sulla pendenza e dell'intercetta.
4. Risultati: curva di calibrazione dell'assorbanza del colorante blu #1
- La curva di calibrazione per l'assorbanza del colorante blu #1 (a 631 nm) è mostrata di seguito (Figura 1). La risposta è lineare da 0 a 10 μM. Al di sopra di tale concentrazione il segnale inizia a livellarsi perché la risposta è al di fuori dell'intervallo lineare dello spettrofotometro UV-Vis.
- Calcola il LOD. Dalla pendenza della curva di calibrazione, il LOD è 3*S.D. (rumore)/m. Per questa curva di calibrazione, il rumore è stato ottenuto prendendo una deviazione standard di misurazioni ripetute ed è stato 0,021. Il LOD sarebbe 3*0.021/.109=0.58 μM.
- Calcola il LOQ. Il LOQ è 10 * S.D. (rumore) / m. Per questa curva di calibrazione, LOQ è 10 * 0,021 / .109 = 1,93 μM.
- Calcola la concentrazione dell'ignoto. Utilizzare l'equazione di linea per calcolare la concentrazione del campione sconosciuto. La curva di calibrazione è valida solo se l'incognita rientra nell'intervallo lineare dei campioni standard. Se le letture sono troppo alte, potrebbe essere necessaria una diluizione. In questo esempio, la bevanda sportiva sconosciuta è stata diluita 1:1. L'assorbanza era di 0,243 e questo corrispondeva ad una concentrazione di 2,02 μM. Così la concentrazione finale di colorante blu #1 nella bevanda sportiva era di 4,04 μM.
Figura 1. Curve di calibrazione per l'assorbanza UV-Vis del colorante blu. A sinistra: l'assorbanza è stata misurata di diverse concentrazioni di colorante blu #1. Le risposte si livellano dopo 10 μM, quando l'assorbanza è superiore a 1. Le barre di errore provengono da misurazioni ripetute dello stesso campione e sono deviazioni standard. A destra: La parte lineare della curva di calibrazione è adatta a una linea, y = 0,109 * x + 0,0286. I dati sconosciuti sono mostrati in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le curve di calibrazione vengono utilizzate per comprendere la risposta strumentale a un analita e per prevedere la concentrazione di analita in un campione.
Una curva di calibrazione viene creata preparando prima una serie di soluzioni standard con concentrazioni note dell'analita. La risposta dello strumento viene misurata per ciascuno e tracciata rispetto alla concentrazione della soluzione standard. La porzione lineare di questo grafico può quindi essere utilizzata per prevedere la concentrazione di un campione dell'analita, correlando la sua risposta alla concentrazione.
Questo video introdurrà le curve di calibrazione e il loro utilizzo, dimostrando la preparazione di una serie di standard, seguiti dall'analisi di un campione con concentrazione sconosciuta.
Una serie di soluzioni standard viene utilizzata per preparare la curva di calibrazione. Queste soluzioni sono costituite da una gamma di concentrazioni che comprendono la concentrazione approssimativa dell'analita.
Le soluzioni standard sono spesso preparate con una diluizione seriale. Una diluizione seriale viene eseguita preparando prima una soluzione stock dell'analita. La soluzione stock viene quindi diluita di una quantità nota, spesso di un ordine di grandezza. La nuova soluzione viene quindi diluita nello stesso modo e così via. Ciò si traduce in una serie di soluzioni con concentrazioni che variano su diversi ordini di grandezza.
La curva di calibrazione è un grafico del segnale strumentale rispetto alla concentrazione. Il grafico degli standard deve essere lineare e può essere adattato all'equazione y = mx + b. Le parti non lineari del grafico dovrebbero essere scartate, poiché questi intervalli di concentrazione sono al di fuori del limite di linearità.
L'equazione della linea più adatta può quindi essere utilizzata per determinare la concentrazione del campione, utilizzando il segnale dello strumento per correlare alla concentrazione. I campioni con misure che si trovano al di fuori dell'intervallo lineare del grafico devono essere diluiti, in modo da essere nell'intervallo lineare.
Il limite di rilevamento dello strumento, o la misura più bassa che può essere determinata statisticamente sul rumore, può essere calcolato anche dalla curva di calibrazione. Un campione vuoto viene misurato più volte. Il limite di rilevamento è generalmente definito come il segnale vuoto medio più 3 volte la sua deviazione standard.
Infine, è possibile calcolare anche il limite di quantificazione. Il limite di quantificazione è la quantità più bassa di analita che può essere quantificata con precisione. Questo è calcolato come 10 deviazioni standard sopra il segnale vuoto.
Ora che hai imparato le basi di una curva di calibrazione, vediamo come prepararne e usarne una in laboratorio.
In primo luogo, preparare una soluzione stock concentrata dello standard. Pesare accuratamente lo standard e trasferirlo in un pallone volumetrico. Aggiungere una piccola quantità di solvente e mescolare in modo che il campione si dissolva. Quindi, riempire la linea con solvente. È importante utilizzare lo stesso solvente del campione.
Per preparare gli standard, pipettare la quantità richiesta nel pallone volumetrico. Quindi riempire il pallone fino alla linea con solvente e mescolare.
Continuare a fare gli standard pipettando dalla soluzione di riserva e diluendo. Per una buona curva di calibrazione, sono necessarie almeno 5 concentrazioni.
Ora, esegui campioni con lo strumento analitico, in questo caso uno spettrofotometro UV-Vis, al fine di determinare la risposta strumentale necessaria per la curva di calibrazione.
Prendi la misura del primo standard. Esegui gli standard in ordine casuale, nel caso in cui ci siano errori sistematici. Misura ogni standard 3-5 volte per ottenere una stima del rumore.
Misurare il resto degli standard, ripetendo le misurazioni per ciascuno. Registrare tutti i dati.
Infine, eseguire l'esempio. Utilizzare la stessa matrice di campioni e le stesse condizioni di misurazione utilizzate per gli standard. Assicurarsi che il campione rientri nell'intervallo degli standard e nel limite dello strumento.
Per costruire la curva di calibrazione, utilizzare un programma per computer per tracciare i dati come segnale rispetto alla concentrazione. Utilizzare la deviazione standard delle misurazioni ripetute per ciascun punto dati per creare barre di errore.
Rimuovete le parti della curva non lineari, quindi eseguite una regressione lineare e determinate la linea più adatta. L'output dovrebbe essere un'equazione nella forma y = m x + b. Un valore R2vicino a 1 denota una buona vestibilità.
Questa è la curva di calibrazione per il colorante blu #1, misurata a 631 nm. La risposta è lineare tra 0 e 15 mM.
Calcola la concentrazione del campione usando l'equazione della linea più adatta. L'assorbanza per il campione era di 0,141 e corrispondeva a una concentrazione di 6,02 mM.
Ora che hai visto come una curva di calibrazione può essere utilizzata con uno spettrofotometro UV-Vis, diamo un'occhiata ad alcune altre applicazioni utili.
Le curve di calibrazione sono spesso utilizzate con applicazioni elettrochimiche, poiché il segnale dell'elettrodo deve essere calibrato sulla concentrazione di ioni nella soluzione. In questo esempio, sono stati raccolti dati per un elettrodo iono-selettivo per il fluoruro.
I dati di concentrazione devono essere tracciati sulla scala di log per ottenere una linea. Questa curva di calibrazione può essere utilizzata per misurare la concentrazione di fluoro in una soluzione, come dentifricio o acqua potabile.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una tecnica di separazione e analisi che viene utilizzata pesantemente nella chimica analitica. L'HPLC separa i componenti di una miscela in base al tempo necessario alle molecole per percorrere la lunghezza della colonna cromatografica. Questo tempo varia a seconda di una serie di proprietà chimiche delle molecole.
L'eluizione delle molecole viene misurata utilizzando un rivelatore, risultando in un cromatogramma. L'area di picco può essere correlata alla concentrazione utilizzando una semplice curva di calibrazione di una gamma di soluzioni standard, come in questo esempio di ingredienti di soda popolari.
In alcuni casi, in cui la matrice della soluzione interferisce con la misurazione del soluto, una curva di calibrazione classica può essere imprecisa. In questi casi, viene preparata una curva di calibrazione modificata. A tale scopo, al campione viene aggiunta una gamma di volumi di soluzioni standard. Viene creato il grafico da segnale a concentrazione, dove l'intercetta x è uguale alla concentrazione originale della soluzione campione. Per maggiori dettagli su questa tecnica, guarda il video di educazione scientifica JoVE, "Il metodo di aggiunta standard".
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla curva di calibrazione. Ora dovresti capire dove viene utilizzata la curva di calibrazione, come crearla e come usarla per calcolare le concentrazioni di campioni.
Come sempre, grazie per aver guardato!
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Applications and Summary
Le curve di calibrazione sono utilizzate in molti campi della chimica analitica, della biochimica e della chimica farmaceutica. È comune usarli con spettroscopia, cromatografia e misurazioni elettrochimiche. Una curva di calibrazione può essere utilizzata per comprendere la concentrazione di un inquinante ambientale in un campione di suolo. Potrebbe essere usato per determinare la concentrazione di un neurotrasmettitore in un campione di fluido cerebrale, vitamina in campioni farmaceutici o caffeina negli alimenti. Pertanto, le curve di calibrazione sono utili nelle applicazioni ambientali, biologiche, farmaceutiche e delle scienze alimentari. La parte più importante della creazione di una curva di calibrazione è quella di creare campioni standard accurati che si trovano in una matrice che si avvicina da vicino alla miscela di campioni.
Di seguito è riportato un esempio di curva di calibrazione elettrochimica (Figura 2). I dati sono stati raccolti con un elettrodo iono-selettivo per il fluoro. I dati elettrochimici seguono l'equazione di Nernst E=E0 + 2,03*R*T/(nF) * log C. Pertanto, i dati di concentrazione (asse x) devono essere tracciati su una scala logaritmo per ottenere una linea. Questa curva di calibrazione potrebbe essere utilizzata per misurare la concentrazione di fluoro nel dentifricio o nell'acqua potabile.
Figura 2. Curva di calibrazione per un elettrodo iono-selettivo. Viene tracciata la risposta di un elettrodo selettivo al fluoro (in mV) a diverse concentrazioni di fluoruro. L'equazione attesa per la risposta dell'elettrodo è y (in mV)=-59,2*log x+b a 25 °C. L'equazione effettiva è y=-57.4*log x +56.38. Il valore R2 è 0,998. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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