Overview
Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia
Curvas de calibración se utilizan para comprender la respuesta instrumental a un analito y predecir la concentración en una muestra desconocida. Por lo general, un conjunto de muestras estándar se hacen a diferentes concentraciones con una gama que incluye al desconocido de interés y se registra la respuesta instrumental en cada concentración. Para más exactitud y comprender el error, se puede repetir la respuesta en cada concentración por lo que se obtiene una barra de error. Los datos entonces se caben con una función por lo que se pueden predecir las concentraciones desconocidas. Por lo general la respuesta es lineal, sin embargo, una curva se puede hacer con otras funciones como la función es conocida. La curva de calibración puede utilizarse para calcular el límite de detección y límite de cuantificación.
Al hacer soluciones para una curva de calibración, cada solución puede hacerse por separado. Sin embargo, puede tomar un montón de material de partida y llevar mucho tiempo. Otro método para hacer muchos diferentes concentraciones de una solución es utilizar diluciones seriadas. Con diluciones seriadas, se diluye una muestra concentrada abajo de una manera paso a paso para hacer concentraciones más bajas. La siguiente muestra es de la dilución anterior, y el factor de dilución a menudo se mantiene constante. La ventaja es que se necesita solamente una solución inicial. La desventaja es que los errores en decisiones de solución, pipetear, formación, etc. — Haz propagado como soluciones más. Por lo tanto, se debe tener cuidado al hacer la solución inicial.
Principles
Curvas de calibración pueden utilizarse para predecir la concentración de una muestra desconocida. Para ser totalmente exactos, las muestras estándar se deben ejecutar en la misma matriz que la muestra desconocida. Una matriz de la muestra es los componentes de la muestra excepto el analito de interés, incluyendo el solvente y todos sales, proteínas, iones metálicos, etc. que pueden estar presentes en la muestra. En la práctica, ejecutando las muestras de calibración en la misma matriz que el desconocido es a veces difícil, como la muestra desconocida se puede partir de una muestra biológica o ambiental complejo. Así, muchas curvas de calibración se realizan en una matriz de la muestra que de cerca se aproxima a la muestra real, como la artificial cerebral espinal líquido o artificial orina, pero puede no ser exacta. El rango de concentraciones de la curva de calibración debe soporte en la muestra desconocida prevista. Idealmente se miden concentraciones unas por encima y por debajo de la muestra de concentración esperado.
Muchas curvas de calibración son lineales y se pueden caber con la ecuación básica y = mx + b, donde m es la pendiente y b es el intercepto de y. Sin embargo, no todas las curvas son lineales y a veces para obtener una línea, uno o ambos ejes será en una escala logarítmica. Regresión lineal se realiza típicamente usando un programa de computadora y el método más común es utilizar un ajuste de mínimos cuadrados. Con un análisis de regresión lineal, se da un valor de R2 , llamado el coeficiente de determinación. Para una regresión individual simple, R2 es el cuadrado del coeficiente de correlación (r) y proporciona información acerca de cuán lejos los valores de y son de la línea prevista. Una línea perfecta tendría un valor de2 R de 1 y más R2 valores de curvas de calibración son sobre 0.95. Cuando la curva de calibración es lineal, la pendiente es una medida de la sensibilidad: cuánto de la señal cambia de un cambio en la concentración. Una línea más escarpada con una pendiente más grande indica una medida más sensible. Una curva de calibración también puede ayudar a definir el rango lineal, el rango de concentraciones que el instrumento da una respuesta lineal. Fuera de este rango, la respuesta puede disminuyen debido a las consideraciones instrumentales, y no puede utilizarse la ecuación de la calibración. Esto se conoce como el límite de linealidad.
Límite de detección es la cantidad mínima que puede determinarse estadísticamente del ruido. Generalmente se define como una señal de que es 3 veces el ruido. El límite de detección puede ser calculado de la pendiente de la curva de calibración y se define generalmente como LOD=3*S.D./m, en Dakota del sur es la desviación estándar del ruido. El ruido se mide tomando la desviación estándar de mediciones múltiples. Por otra parte, en un rastro, ruido puede estimarse como la desviación estándar de la línea de base. El límite de cuantificación es la cantidad que puede ser distinguida entre muestras y generalmente se define como 10 veces el ruido.
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Procedure
1. hacer los estándares: diluciones seriadas
- Hacer una solución madre concentrada de la norma. Normalmente, el compuesto es exactamente pesado y transfieren cuantitativamente a un matraz volumétrico. Añadir solvente, mezcla por lo que la muestra se disuelve, luego llene hasta la línea con el solvente adecuado.
- Realizar diluciones seriadas. Tomar otro matraz volumétrico y pipetear la cantidad de estándar necesario para la dilución, luego llenar hasta la línea con solvente y mezclar. Una dilución diez veces es por lo general, de un matraz aforado de 10 mL, añadir 1 mL de la dilución anterior.
- Continuar según sea necesario para más diluciones, uso de la solución anterior para diluir para hacer la siguiente muestra. Para una curva de calibración buena, se necesitan al menos 5 concentraciones.
2. ejecutar los ejemplos de la curva de calibración y lo desconocido
- Ejecutar los ejemplos con el espectrofotómetro de UV-Vis para determinar la respuesta instrumental necesaria para la curva de calibración.
- Tomar la lectura con la primera muestra. Es una buena idea para ejecutar las muestras en orden aleatorio (es decir, no más alto al más bajo o más bajo a más alto) en caso de que hay algún error sistemático. Con el fin de obtener una estimación del ruido, repita la lectura en cualquier muestra dada x 3 – 5.
- Ejecutar los ejemplos estándar adicionales, repetir las mediciones para cada muestra obtener una estimación del ruido. Registrar los datos para hacer una trama más adelante.
- Ejecutar las muestras desconocidas. Utilizar como condiciones similares a la ejecución de las normas como sea posible. Así, la matriz de la muestra o el tampón debe ser el mismo, el pH debe ser el mismo, y la concentración debe ser en la gama de los estándares de ejecutar.
3. hacer la curva de calibración
- Registrar los datos en una hoja de cálculo y utilizar un programa de computadora para representar la concentración de datos vs. Si se tomaron medidas al menos por triplicado para cada punto, se pueden trazar la barras de error de la desviación estándar de las mediciones para estimar el error de cada punto. Para algunas curvas, los datos necesario trazar un eje como un registro para obtener una línea. La ecuación que gobierna la curva de calibración se conoce generalmente antes de tiempo, por lo que una parcela de registro se utiliza cuando hay un registro en la ecuación.
- Examinar la curva de calibración. ¿Parece lineal? ¿Tiene una parte que se ve no lineal (es decir, alcanzado el límite de la respuesta instrumental)? Para comprobar, ajustar todos los datos para una regresión lineal utilizando el software. Si el coeficiente de determinación (R2) no es alta, quitar algunos de los puntos al principio o al final de la curva que no aparecen caber la línea y realizar otra vez la regresión lineal. No es aceptable para quitar los puntos en el centro sólo porque tienen una barra de error grande. De este análisis, decidir qué porción de la curva es lineal.
- La salida del lineal debe ser una ecuación de la formato y = mx + b, donde m es la pendiente y b es el intercepto de y. Las unidades de la pendiente son la unidad de eje y o concentración, en este ejemplo (figura 1) absorbancia/μM. Las unidades de la intersección son las unidades del eje y. Se obtiene un coeficiente de determinación (R2). Cuanto mayor sea el R2 mejor el ajuste; un ajuste perfecto da un R2 de 1. El programa también puede ser capaz de dar una estimación del error de la pendiente y el intercepto.
4. resultados: Curva de calibración de absorbancia del colorante azul #1
- La curva de calibración de absorbancia del colorante azul #1 (en 631 nm) se muestra a continuación (figura 1). La respuesta es lineal de 0 a 10 μm. sobre que concentración de la señal comienza a nivel de porque la respuesta está fuera del rango lineal del espectrofotómetro UV-Vis.
- Calcular el LOD. De la pendiente de la curva de calibración, es el LOD 3*S.D. (ruido) / m. Para esta curva de calibración, el ruido se obtuvo tomando una desviación estándar de mediciones repetidas y 0.021. El LDD sería 3*0.021/.109=0.58 μm.
- Calcular la LDC El LOQ es 10*S.D. (ruido) / m. Para esta curva de calibración, LOQ es 10*0.021/.109 = 1.93 μm.
- Calcular la concentración del desconocido. Utilice la ecuación de la línea para calcular la concentración de la muestra desconocida. La curva de calibración sólo es válida si el desconocido cae en el rango lineal de las muestras estándar. Si las lecturas son demasiado altas, la dilución puede ser necesaria. En este ejemplo, la bebida de deportes desconocidos fue diluido 1:1. La absorbancia fue 0.243 y esto correspondió a una concentración de 2.02 μm. Así la concentración final de colorante azul #1 en los en los deportes de bebida era 4.04 μm.
Figura 1. Curvas de calibración de absorbancia UV-Vis de colorante azul. Izquierda: se midió la absorbancia de diferentes concentraciones de colorante azul #1. Las respuestas de nivel después de 10 μm, cuando la absorbancia es más de 1. Las barras de error son de medidas repetidas de la misma muestra y desviación estándar. Derecho: La parte lineal de la curva de calibración se cabe con una línea y = 0,109 * x + 0.0286. En negro se muestran los datos desconocidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Curvas de calibración se usan para entender la respuesta instrumental a un analito y para predecir la concentración de analito en una muestra.
Una curva de calibración se crea con la primera preparación de un conjunto de soluciones estándar con concentraciones conocidas del analito. La respuesta del instrumento es medida para cada uno y conspiró contra la concentración de la solución estándar. La parte lineal de este terreno puede utilizarse entonces para predecir la concentración de una muestra de analito, al correlacionar su respuesta a la concentración.
Este video presenta las curvas de calibración y su uso, demostrando la preparación de un conjunto de normas, seguida por el análisis de una muestra con concentración desconocida.
Un conjunto de soluciones estándar se utiliza para preparar la curva de calibración. Estas soluciones consisten en una gama de concentraciones que abarcan la concentración aproximada del analito.
Soluciones estándar son preparadas a menudo con una dilución seriada. Una dilución seriada se realiza con la primera preparación de una solución del analito. La solución entonces se diluye en una cantidad conocida, a menudo una orden de la magnitud. La nueva solución es luego diluida en la misma manera y así sucesivamente. Esto resulta en un conjunto de soluciones con concentraciones que se extienden sobre varios órdenes de magnitud.
La curva de calibración es una parcela de señal instrumental vs concentración. La trama de las normas debe ser lineal y se puede caber con la ecuación y = mx + b. Las porciones no-lineal de la trama deben ser descartadas, como son estos rangos de concentración en el límite de linealidad.
La ecuación de la línea de mejor ajuste puede entonces utilizarse para determinar la concentración de la muestra, usando la señal del instrumento se correlacionan con la concentración. Se deberán diluir las muestras con las medidas que se encuentran fuera del rango lineal de la trama, con el fin de estar en el rango lineal.
El límite de detección del instrumento o la medición más baja que puede ser determinada estadísticamente sobre el ruido, se puede calcular de la curva de calibración también. Una muestra en blanco se mide varias veces. El límite de detección se define generalmente como la señal promedio en blanco más 3 veces su desviación estándar.
Por último, también se puede calcular el límite de cuantificación. El límite de cuantificación es la mínima cantidad de analito que puede ser cuantificada con exactitud. Esto se calcula como 10 desviaciones estándar por encima de la señal en blanco.
Ahora que has aprendido los conceptos básicos de una curva de calibración, vamos a ver cómo preparar y utilizar uno en el laboratorio.
En primer lugar, preparar una solución stock concentrada de la norma. Con precisión pesan el estándar y transferir a un matraz aforado. Agregue una pequeña cantidad de disolvente y mezclar para que se disuelva la muestra. Luego, llene la línea con el solvente. Es importante utilizar el mismo solvente como la muestra.
Para preparar los estándares, pipetear la cantidad requerida en el matraz aforado. Luego llene el matraz a la línea con solvente y mezclar.
Seguir haciendo las normas por uso de la solución y diluir. Para una curva de calibración buena, se necesitan al menos 5 concentraciones.
Ejecutar las muestras con el instrumento analítico, ahora, en este caso un espectrofotómetro UV-Vis, con el fin de determinar la respuesta instrumental necesario para la curva de calibración.
Tomar la medida del primer estándar. Ejecutar las normas en orden aleatorio, en caso de que hay algún error sistemático. Medir cada estándar 3-5 veces para obtener una estimación del ruido.
Medir el resto de las normas, repetir las mediciones para cada uno. Registrar todos los datos.
Por último, ejecutar el ejemplo. Utilice las mismas condiciones de medición y matriz de la muestra ya que se utilizaron para las normas. Asegúrese de que la muestra está dentro del rango de las normas y el límite del instrumento.
Para construir la curva de calibración, use un programa de computadora para representar los datos como señal vs concentración. Utilizar la desviación estándar de las mediciones repetidas para cada punto de datos para hacer barras de error.
Saque porciones de la curva que son no lineales, y luego realizan una regresión lineal y determinan la línea de mejor ajuste. La salida debería ser una ecuación en la forma y = m x + b. Un R2-valor cerca de 1 indica un buen ajuste.
Esta es la curva de calibración para colorante azul #1, medidos en 631 nm. La respuesta es lineal entre 0 y 15 mM.
Calcular la concentración de la muestra utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste. La absorbancia de la muestra fue 0.141 y correspondió a una concentración de 6,02 mM.
Ahora que has visto cómo se puede utilizar una curva de calibración con un espectrofotómetro UV-Vis, echemos un vistazo a algunas otras aplicaciones útiles.
Curvas de calibración se utilizan a menudo con aplicaciones de la electroquímica, como la señal del electrodo debe ser calibrada a la concentración de iones en la solución. En este ejemplo, los datos fueron recogidos por un electrodo selectivo de iones de fluoruro.
Los datos de concentración se deben trazar en la escala de registro para obtener una línea. Esta curva de calibración puede utilizarse para medir la concentración de fluoruro en una solución, como pasta de dientes o agua potable.
Cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, es una separación y una técnica de análisis que se usa mucho en química analítica. HPLC separa los componentes de una mezcla basada en el tiempo requerido para que las moléculas viajar la longitud de la columna de cromatografía. Este tiempo varía en función de una gama de propiedades químicas de las moléculas.
La elución de las moléculas se mide mediante un detector, resultando en un cromatograma. El área de pico puede ser correlacionado a concentración mediante una curva de calibración simple de una gama de soluciones estándar, como en este ejemplo de los ingredientes de la popular soda.
En algunos casos, donde la matriz solución interfiere con la medición del soluto, una curva de calibración clásica puede ser imprecisa. En esos casos, se prepara una curva de calibración modificado. Para esto, una gama de volúmenes de solución estándar se añade a la muestra. Se crea la señal a la trama de concentración, donde el intercepto de x es igual a la concentración de la solución de la muestra original. Para obtener más detalles sobre esta técnica, por favor ver la enseñanza de las Ciencias JoVE video, "el método de adición estándar".
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la curva de calibración. Ahora debería entender donde se utiliza la curva de calibración, cómo crearla y cómo se utiliza para calcular las concentraciones de las muestras.
¡Como siempre, gracias por ver!
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Applications and Summary
Curvas de calibración se utilizan en muchos campos de la química analítica, bioquímica y química farmacéutica. Es común utilizar con espectroscopía, cromatografía y mediciones de electroquímica. Una curva de calibración puede utilizarse para entender la concentración de un contaminante ambiental en una muestra de suelo. Podría ser utilizado determinar la concentración de un neurotransmisor en una muestra de líquido del cerebro, vitamina en las muestras farmacéuticas o cafeína en los alimentos. Así, las curvas de calibración son útiles en aplicaciones de ciencia ambientales, biológicos, farmacéuticos y alimentos. La parte más importante de hacer una curva de calibración es hacer precisas muestras estándar que se encuentran en una matriz que se aproxima estrechamente a la mezcla de muestra.
Continuación (figura 2) se muestra un ejemplo de una curva de calibración de electroquímica. Los datos fueron recogidos con un electrodo selectivo de iones de fluoruro. Datos electroquímicos seguir la ecuación de Nernst E = E0 + 2.03*R*T/(nF) * registro C. Así, los datos de concentración (eje x) se deben trazar en una escala logarítmica para obtener una línea. Esta curva de calibración podría utilizarse para medir la concentración de fluoruro en la pasta de dientes o agua potable.
Figura 2. Curva de calibración de un electrodo selectivo de iones. Se traza la respuesta de un electrodo selectivo de fluoruro (en mV) a diferentes concentraciones de fluoruro. La ecuación que de la respuesta del electrodo es y (en mV) =-59,2 * log x + b a 25 ° C. La ecuación real es y =-57.4 * log x +56.38. El valor de R2 es 0.998. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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