Overview
Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia
As curvas de calibração são usadas para entender a resposta instrumental a um analito e prever a concentração em uma amostra desconhecida. Geralmente, um conjunto de amostras padrão são feitas em várias concentrações com uma faixa que inclui o desconhecido de interesse e a resposta instrumental em cada concentração é registrada. Para obter mais precisão e entender o erro, a resposta em cada concentração pode ser repetida para que uma barra de erro seja obtida. Os dados são então adequados com uma função para que concentrações desconhecidas possam ser previstas. Normalmente a resposta é linear, no entanto, uma curva pode ser feita com outras funções, desde que a função seja conhecida. A curva de calibração pode ser usada para calcular o limite de detecção e limite de quantitação.
Ao fazer soluções para uma curva de calibração, cada solução pode ser feita separadamente. No entanto, isso pode levar muito material inicial e ser demorado. Outro método para fazer muitas concentrações diferentes de uma solução é usar diluições seriais. Com diluições seriais, uma amostra concentrada é diluída de forma stepwise para fazer concentrações mais baixas. A próxima amostra é feita a partir da diluição anterior, e o fator de diluição é muitas vezes mantido constante. A vantagem é que apenas uma solução inicial é necessária. A desvantagem é que quaisquer erros na criação de soluções — pipetação, massing, etc.— são propagados à medida que mais soluções são feitas. Assim, deve-se tomar cuidado ao fazer a solução inicial.
Principles
Curvas de calibração podem ser usadas para prever a concentração de uma amostra desconhecida. Para ser completamente preciso, as amostras padrão devem ser executadas na mesma matriz da amostra desconhecida. Uma matriz amostral são os componentes da amostra que não o analito de interesse, incluindo o solvente e todos os sais, proteínas, íons metálicos, etc. que podem estar presentes na amostra. Na prática, a execução de amostras de calibração na mesma matriz do desconhecido às vezes é difícil, pois a amostra desconhecida pode ser de uma amostra biológica ou ambiental complexa. Assim, muitas curvas de calibração são feitas em uma matriz amostral que aproxima de perto a amostra real, como fluido espinhal cerebral artificial ou urina artificial, mas pode não ser exato. A faixa de concentrações da curva de calibração deve ser aquessalta na amostra desconhecida esperada. O ideal é medir algumas concentrações acima e abaixo da amostra de concentração esperada.
Muitas curvas de calibração são lineares e podem ser encaixados com a equação básica y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. No entanto, nem todas as curvas são lineares e às vezes para obter uma linha, um ou ambos os conjuntos de eixos estarão em uma escala logarítmica. A regressão linear é normalmente realizada usando um programa de computador e o método mais comum é usar um ajuste de menos quadrados. Com uma análise de regressão linear, é dado um valor R2, chamado de coeficiente de determinação. Para uma simples regressão única, R2 é o quadrado do coeficiente de correlação (r) e fornece informações sobre quão distantes os valores y estão da linha prevista. Uma linha perfeita teria um valor R2 de 1, e a maioria dos valores R2 para curvas de calibração são superiores a 0,95. Quando a curva de calibração é linear, a inclinação é uma medida de sensibilidade: o quanto o sinal muda para uma mudança na concentração. Uma linha mais íngreme com uma inclinação maior indica uma medição mais sensível. Uma curva de calibração também pode ajudar a definir a faixa linear, a faixa de concentrações que o instrumento dá uma resposta linear. Fora deste intervalo, a resposta pode diminuir devido a considerações instrumentais, e a equação da calibração não pode ser usada. Isso é conhecido como o limite da linearidade.
O limite de detecção é a menor quantidade que pode ser estatisticamente determinada a partir do ruído. Geralmente isso é definido como um sinal que é 3 vezes o ruído. O limite de detecção pode ser calculado a partir da inclinação da curva de calibração e é geralmente definido como LOD=3*S.D./m, onde S.D. é o desvio padrão do ruído. O ruído é medido tomando o desvio padrão de múltiplas medidas. Alternativamente, em um traço, o ruído pode ser estimado como o desvio padrão da linha de base. O limite de quantitação é a quantidade que pode ser diferenciada entre as amostras e geralmente é definida como 10 vezes o ruído.
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Procedure
1. Fazendo os Padrões: Diluições seriais
- Faça uma solução concentrada de estoque do padrão. Normalmente, o composto é pesado com precisão e, em seguida, transferido quantitativamente para um frasco volumoso. Adicione algum solvente, misture para que a amostra se dissolva e, em seguida, encha a linha com o solvente adequado.
- Realizar diluições seriais. Pegue outro frasco volumoso e pipeta a quantidade de padrão necessária para a diluição, em seguida, encha a linha com solvente e misture. Uma diluição de dez vezes é tipicamente feita, por isso para um frasco volumoso de 10 mL, adicione 1 mL da diluição anterior.
- Continue conforme necessário para mais diluições, pipetando da solução anterior para diluí-la para fazer a próxima amostra. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.
2. Execute as amostras para a Curva de Calibração e a Desconhecida
- Execute as amostras com o espectrômetro UV-Vis para determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
- Faça a leitura com a primeira amostra. É uma boa ideia executar as amostras em ordem aleatória ( ouseja, não mais alta para menor ou mais baixa para alta) no caso de haver algum erro sistemático. Para obter uma estimativa de ruído, repita a leitura em qualquer amostra 3-5x.
- Execute as amostras padrão adicionais, repetindo as medidas para cada amostra para obter uma estimativa de ruído. Registo os dados para fazer um plot posterior.
- Execute a amostra desconhecida( s). Use condições semelhantes para executar as normas possível. Assim, a matriz amostral ou tampão deve ser o mesmo, o pH deve ser o mesmo, e a concentração deve estar na faixa das normas executadas.
3. Fazendo a curva de calibração
- Registo os dados em uma planilha e use um programa de computador para traçar os dados versus concentração. Se pelo menos medidas triplicadas forem tomadas para cada ponto, as barras de erro podem ser traçadas do desvio padrão dessas medidas para estimar o erro de cada ponto. Para algumas curvas, os dados podem precisar ser plotados com um eixo como um tronco para obter uma linha. A equação que rege a curva de calibração é geralmente conhecida antes do tempo, de modo que um plot de log é usado quando há um registro na equação.
- Examine a curva de calibração. Parece linear? Tem uma porção que parece não linear ( ouseja, atingiu o limite da resposta instrumental)? Para verificar, encaixe todos os dados para uma regressão linear usando o software. Se o coeficiente de determinação (R2) não for alto, remova alguns dos pontos no início ou final da curva que não parecem se encaixar na linha e realize novamente a regressão linear. Não é aceitável remover pontos no meio só porque eles têm uma grande barra de erro. A partir desta análise, decida qual parte da curva é linear.
- A saída do linear deve ser uma equação do formato y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. As unidades para a inclinação são a unidade/concentração do eixo y, neste exemplo (Figura 1) absorção/μM. As unidades para a interceptação y são as unidades do eixo Y. Um coeficiente de determinação (R2) é obtido. Quanto maior o R2, melhor o ajuste; um ajuste perfeito dá um R2 de 1. O programa também pode ser capaz de dar uma estimativa do erro na encosta e na interceptação.
4. Resultados: Curva de Calibração da Absorvância de Corante Azul #1
- A curva de calibração para absorção de #1 de corante azul (a 631 nm) é mostrada abaixo(Figura 1). A resposta é linear de 0 a 10 μM. Acima dessa concentração o sinal começa a nivelar porque a resposta está fora da faixa linear do espectrofotômetro UV-Vis.
- Calcule o LOD. Da inclinação da curva de calibração, o LOD é de 3*S.D. (ruído)/m. Para esta curva de calibração, o ruído foi obtido tomando um desvio padrão de medições repetidas e foi de 0,021. O LOD seria de 3*0,021/.109=0,58 μM.
- Calcule o LOQ. O LOQ é 10*S.D.(ruído)/m. Para esta curva de calibração, LOQ é 10 * 0,021/.109 =1,93 μM.
- Calcule a concentração do desconhecido. Use a equação da linha para calcular a concentração da amostra desconhecida. A curva de calibração só é válida se o desconhecido cair na faixa linear das amostras padrão. Se as leituras forem muito altas, a diluição pode ser necessária. Neste exemplo, a bebida esportiva desconhecida foi diluída 1:1. A absorvância foi de 0,243 e isso correspondeu a uma concentração de 2,02 μM. Assim, a concentração final de corante azul #1 na bebida esportiva foi de 4,04 μM.
Figura 1. Curvas de calibração para absorvância UV-Vis de corante azul. Esquerda: A absorvância foi medida de diferentes concentrações de corante azul #1. As respostas se nivelam após 10 μM, quando a absorvância for superior a 1. As barras de erro são de medidas repetidas da mesma amostra e são desvios padrão. Certo: A porção linear da curva de calibração é encaixada com uma linha, y=0,109 * x + 0,0286. Os dados desconhecidos são mostrados em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As curvas de calibração são usadas para entender a resposta instrumental a um analito, e prever a concentração de analito em uma amostra.
Uma curva de calibração é criada primeiro preparando um conjunto de soluções padrão com concentrações conhecidas do analito. A resposta do instrumento é medida para cada um, e plotada versus concentração da solução padrão. A porção linear deste enredo pode então ser usada para prever a concentração de uma amostra do analito, correlacionando sua resposta à concentração.
Este vídeo introduzirá curvas de calibração e seu uso, demonstrando a elaboração de um conjunto de padrões, seguido da análise de uma amostra com concentração desconhecida.
Um conjunto de soluções padrão é usado para preparar a curva de calibração. Essas soluções consistem em uma gama de concentrações que abrangem a concentração aproximada do analito.
As soluções padrão são muitas vezes preparadas com uma diluição serial. Uma diluição serial é realizada primeiro preparando uma solução de estoque do analito. A solução de estoque é então diluída por uma quantidade conhecida, muitas vezes uma ordem de magnitude. A nova solução é então diluída da mesma forma, e assim por diante. Isso resulta em um conjunto de soluções com concentrações que variam ao longo de várias ordens de magnitude.
A curva de calibração é um gráfico de sinal instrumental versus concentração. O enredo dos padrões deve ser linear, e pode ser adequado com a equação y=mx+b. As porções não lineares da trama devem ser descartadas, pois essas faixas de concentração estão fora do limite da linearidade.
A equação da linha mais adequada pode então ser usada para determinar a concentração da amostra, usando o sinal de instrumento para se correlacionar com a concentração. As amostras com medidas que estão fora da faixa linear da trama devem ser diluídas, a fim de estar na faixa linear.
O limite de detecção do instrumento, ou a menor medida que pode ser estatisticamente determinada sobre o ruído, também pode ser calculado a partir da curva de calibração. Uma amostra em branco é medida várias vezes. O limite de detecção é geralmente definido como o sinal em branco médio mais 3 vezes o seu desvio padrão.
Finalmente, o limite de quantificação também pode ser calculado. O limite de quantificação é a menor quantidade de analito que pode ser quantificada com precisão. Isso é calculado como 10 desvios padrão acima do sinal em branco.
Agora que você aprendeu o básico de uma curva de calibração, vamos ver como preparar e usar um em laboratório.
Primeiro, prepare uma solução concentrada de estoque do padrão. Pesar com precisão o padrão e transferi-lo para um frasco volumoso. Adicione uma pequena quantidade de solvente e misture para que a amostra se dissolva. Em seguida, encha a linha com solvente. É importante usar o mesmo solvente da amostra.
Para preparar as normas, pipeta a quantidade necessária no frasco volumoso. Em seguida, encha o frasco para a linha com solvente, e misture.
Continue fazendo as normas, pipetando a partir da solução de estoque e diluindo. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.
Agora, execute amostras com o instrumento analítico, neste caso um espectrofotômetro UV-Vis, a fim de determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
Faça a medição do primeiro padrão. Execute as normas em ordem aleatória, caso haja erros sistemáticos. Meça cada padrão 3-5x para obter uma estimativa de ruído.
Meça o resto das normas, repetindo as medidas para cada um. Registos.
Finalmente, execute a amostra. Utilize a mesma matriz amostral e condições de medição utilizadas para as normas. Certifique-se de que a amostra está dentro do intervalo das normas e do limite do instrumento.
Para construir a curva de calibração, use um programa de computador para traçar os dados como sinal versus concentração. Use o desvio padrão das medições repetidas para cada ponto de dados para cometer barras de erro.
Remova partes da curva que não são lineares, em seguida, realize uma regressão linear e determine a linha mais adequada. A saída deve ser uma equação na forma y = m x + b. Um valor R2perto de 1 denota um bom ajuste.
Esta é a curva de calibração para #1 de corante azul, medida em 631 nm. A resposta é linear entre 0 e 15 mM.
Calcule a concentração da amostra usando a equação da linha mais adequada. A absorvância da amostra foi de 0,141, correspondendo a uma concentração de 6,02 mM.
Agora que você viu como uma curva de calibração pode ser usada com um espectrômetro UV-Vis, vamos dar uma olhada em algumas outras aplicações úteis.
As curvas de calibração são frequentemente usadas com aplicações eletroquímicas, pois o sinal de eletrodo deve ser calibrado para a concentração de íons na solução. Neste exemplo, foram coletados dados para um eletrodo seletivo de íons para flúor.
Os dados de concentração devem ser plotados na escala de registro para obter uma linha. Esta curva de calibração pode ser usada para medir a concentração de flúor em uma solução, como pasta de dente ou água potável.
Cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC, é uma técnica de separação e análise que é fortemente usada em química analítica. O HPLC separa os componentes de uma mistura com base no tempo necessário para que as moléculas viajem o comprimento da coluna de cromatografia. Este tempo varia dependendo de uma série de propriedades químicas das moléculas.
A elução das moléculas é medida usando um detector, resultando em um cromatograma. A área de pico pode ser correlacionada à concentração usando uma simples curva de calibração de uma gama de soluções padrão, como neste exemplo de ingredientes populares de refrigerante.
Em alguns casos, quando a matriz de solução interfere na medição do soluto, uma curva clássica de calibração pode ser imprecisa. Nesses casos, é preparada uma curva de calibração modificada. Para isso, uma gama de volumes de solução padrão é adicionada à amostra. O sinal para o gráfico de concentração é criado, onde o x intercept é igual à concentração original da solução amostral. Para mais detalhes sobre esta técnica, assista ao vídeo de educação científica do JoVE, "O método de adição padrão".
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à curva de calibração. Agora você deve entender onde a curva de calibração é usada, como criá-la e como usá-la para calcular concentrações de amostras.
Como sempre, obrigado por assistir!
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Applications and Summary
As curvas de calibração são usadas em muitos campos de química analítica, bioquímica e química farmacêutica. É comum usá-los com medições de espectroscopia, cromatografia e eletroquímica. Uma curva de calibração pode ser usada para entender a concentração de um poluente ambiental em uma amostra de solo. Pode ser usado para determinar a concentração de um neurotransmissor em uma amostra de fluido cerebral, vitamina em amostras farmacêuticas ou cafeína em alimentos. Assim, as curvas de calibração são úteis em aplicações ambientais, biológicas, farmacêuticas e de ciências alimentares. A parte mais importante de fazer uma curva de calibração é fazer amostras padrão precisas que estão em uma matriz que se aproxima de perto da mistura de amostras.
Um exemplo de curva de calibração eletroquímica é mostrado abaixo(Figura 2). Os dados foram coletados com um eletrodo seletivo de íons para flúor. Os dados eletroquímicos seguem a equação Nernst E=E0 + 2,03*R*T/(nF) * log C. Assim, os dados de concentração (x-eixo) devem ser plotados em uma escala de log para obter uma linha. Esta curva de calibração poderia ser usada para medir a concentração de flúor em pasta de dente ou água potável.
Figura 2. Curva de calibração para um eletrodo seletivo de íons. A resposta de um eletrodo seletivo de flúor (em mV) a diferentes concentrações de flúor é traçada. A equação esperada para a resposta do eletrodo é y (em mV)=-59,2 * log x+b a 25 °C. A equação real é y=-57.4 * log x +56.38. O valor de R2 é de 0,998. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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