Overview
Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en
Un requisito fundamental de la investigación biomédica es la correcta identificación de los animales de investigación. Es esencial que el animal adecuado es utilizado para la recolección de datos y procedimientos. Las ratas y ratones de laboratorio se pueden identificar con los siguientes métodos permanentes: etiquetas de oído, oído punch códigos, implantación de microchip, tatuajes cola de ratones adultos y del dedo del pie tatuajes para los recién nacidos. Métodos temporales de tintes y bolígrafos de marca también pueden utilizarse para estudios agudos. Este video cubre los aspectos técnicos del oído marcado y perforación para ratones y ratas, así como los beneficios de cada uno con respecto al tipo de investigación que está llevando a cabo en los animales. Conocimiento de las técnicas de inmovilización manual básico para cada animal (cubierto en un video aparte) se requiere de estos métodos de identificación para realizarse correctamente.
Principles
Etiquetas de oído son baratos y fáciles de realizar y como resultado se utilizan para la identificación de los ratones y ratas. Etiquetas pueden ser por encargo con una serie de números o letras. Asignación de códigos específicos a una cepa de ratón/rata, o a un investigador del principio (PI), asesores en gestión de mantenimiento de registros y base de datos, sobre todo en colonias de crianza grandes donde existen múltiples variedades y PIs. Además, hay una gran variedad de etiquetas disponibles en el mercado. Etiquetas metálicas tienen caracteres grabados en ellos. Aunque este grabado es claro, cuando trabajo con un ratón a menudo es necesario recogerlo para leer el código de las etiquetas debido al pequeño tamaño de las etiquetas. Otras opciones son las etiquetas de plástico con números o letras sobre fondos de colores brillantes, o plástico etiquetas con un código de barras en la superficie frontal. Estas opciones permiten que las etiquetas ser leído sin tener que manejar los animales. Otra ventaja de etiquetas de plástico es su compatibilidad con la proyección de imagen de MRI.
La colocación de la etiqueta en la oreja es crítica, colocación incorrecta puede tener varias consecuencias desafortunadas. Etiquetas deben colocarse de tal manera que no causa una curva en el pabellón de la oreja, interferir en la movilidad del animal o atorarse en alguna pieza de la jaula. Si la etiqueta se coloca demasiado cerca al borde de la oreja puede fácilmente ser rasgado de los tejidos de la oreja. Si está situado demasiado cerca a la cabeza, la piel de la zona del cuello puede coger en la etiqueta, que creará irritación, dolor y movimiento limitado. Esto puede conducir a self-trauma del animal rascarse la etiqueta, ripeo del oído, o conseguir un pie en la etiqueta. Entrenamiento para la colocación correcta y la técnica es esencial. 1
Mientras que las etiquetas proporcionan identificadores individuales para ratones o ratas, no son infalibles. Etiquetas pueden ser perdidas debido a la lucha, demasiado acicalado, dermatitis en cepas susceptibles, la infección o la uno mismo-trauma. 2 ratas adultas en particular son menos tolerantes de marcas auriculares y eliminarlos a menudo, causando trauma de uno mismo. El comportamiento más agresivo de la reproducción en ratas también puede conducir a un arete escindiéndose de la oreja. Si los ratones o ratas son apareados o alojados en grupo, la pérdida de un arete con más de un animal puede ser problemática. Para evitar este problema, una forma secundaria de identificación, tales como un código de golpe en el oído del lado opuesto de la etiqueta, o un tatuaje cola o dedo del pie-deberían utilizarse. Una instalación debe estandarizar la opción del oído para ser etiquetados y el código para ser utilizado en la otra oreja o en los dedos del pie. Todos los códigos se indicarán en la tarjeta de la jaula.
El uso de códigos de perforación de oído permite un método rápido y simple de la identificación, pero la técnica tiene limitaciones. Los códigos utilizados tienen un límite superior para los números disponibles para su uso, generalmente un máximo de 100 a 399. Para leer los códigos de perforación de oreja, mayoría de los animales debe ser comprendida en el pescuezo. Los golpes pueden duplicar como muestras de tejido para la genotipificación de la PCR, que permite la identificación de animales y muestreo de genotipo a realizarse simultáneamente. Esto resulta en menos estrés a los animales de manipulación repetida. 3
Hay tres estilos de oído golpes: el golpe de tijera, el golpe de pulgar y el golpe de palanca. Aunque todos son igual de eficaces, hay ventajas y desventajas a cada uno. Por ejemplo, como la edad de las ratas, espesa la piel de las orejas. Es mejor realizar los golpes de oído en ratas jóvenes como ellos son destetados. Para ratas adultas que requieren identificación, se debe considerar el uso de inhalante anestesia. Ergonómicamente, el punzón nivel es fácil de usar que un golpe de pulgar, especialmente para los oídos más gruesos de las ratas más viejas. Sin embargo, ambos de estos golpes requieren un movimiento de pellizco de los dedos. El golpe de tijera tiene la ventaja ergonómica de no requerir un movimiento de pellizco, evitando lesiones y fatiga de túnel carpiano. Por el contrario, el golpe de pulgar es ventajoso para recoger el Genotipado de las muestras, como las puntas con el material tejido encajará en un tubo Eppendorf. El estilo de golpe a utilizar se determinará por los individuos llevar a cabo la tarea y la edad de las ratas.
Para las ratas, aunque más a menudo se utilizan etiquetas de metal, estudios han demostrado que existen consecuencias para su uso. Inflamación, cambios neoplásticos y dolor crónico incluso se han observado en animales que han usado marcas auriculares metal durante varios meses. 3,4,5,6 las etiquetas deben ser inmediatamente retiradas del oído si hay una reacción adversa, y la posterior lesión debe examinar y tratar, si es necesario, por el personal veterinario.
Cuidado y mantenimiento de golpes extienden su uso. Todo tipo de golpes opacarán si esterilizado, por lo que se recomienda limpiar con un desinfectante y enjuague con alcohol. Entonces, ellos deben ser completamente secados para evitar que se oxiden. Si los golpes se utilizan para PCR, deben ser remojados durante 3 minutos en una solución que elimina residuos ADN o ARN. Antes de su uso son aclarados con alcohol y secarse.
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Procedure
1. identificación de golpe oído
Códigos de perforación de oído se han desarrollado como un método rápido y económico para identificar animales individuales. Hay tres estilos de oído golpes: el golpe de tijera, el golpe de pulgar y el golpe de palanca. Oreja derecha del animal se utiliza para el solo dígito, el oído izquierdo por decenas y el centro de las orejas para cientos.
- Refrenar el animal para que las orejas son fácilmente accesibles. La mayoría los ratones son oído con la etiqueta de identificación individual al destete. Esto requiere un manejo suave debido a su tamaño más pequeño, más frágil. Algunos ratones son menos propensas a luchar si los miembros posteriores puede descansar sobre una superficie como una jaula o un contador.
- Determinar los golpes de oído es necesarios corresponde al número experimental del animal o identificar dentro de una jaula.
- Golpes serán muescas o agujeros según el código utilizado.
- El último número en la etiqueta de oído a menudo se utiliza como el identificador de punzón de oreja cuando este es el método secundario de identificación.
- Si los animales están en un estudio a corto plazo en grupos estables de la jaula, se pueden administrar números secuenciales. Esto se hace a menudo cuando hay no hay etiquetas de oído presente.
- Hacer el oído golpear.
- Para hacer una muesca, el punzón se coloca en el borde del pabellón de la oreja del oído.
- Para hacer un agujero, poner el oído en el golpe que el agujero del sacador se coloca fuera del margen del pabellón de la oreja en la posición deseada.
- Aplique presión al pulgar o golpe de palanca o cerrar la tijera golpear rápidamente y con firmeza para cortar a través de la piel de la oreja.
- Levante suavemente el punzón de la oreja cuando se utiliza el pulgar o palanca de golpes. Abra el golpe de tijera para quitárselo de la oreja.
- Evite tirar o torcer el golpe para evitar desgarro del oído.
- Golpes embotado después de tiempo. Si un golpe no corte a través del oído, suelta el golpe y seleccione un nuevo golpe de oreja. Vuelva a colocar el nuevo golpe en el mismo lugar.
- Limpie los golpes después de cada uso.
- Todos los tipos de golpe opacarán si esterilizado. Se recomienda que se limpia con un desinfectante y aclararlo con alcohol. Secar completamente para evitar que se oxiden.
- Golpes de oído para PCR son rutinariamente empapados durante 3 minutos en una solución para eliminar residuos ADN o ARN. Antes de su uso son aclarados con alcohol y secarse.
Figura 1. Perforación en ratones con tijera punzón de oreja.
2. identificación de la etiqueta de oído
Marcas auriculares personalizados se pueden pedir de fabricantes con los códigos alfabéticos o numéricos, que permite la diferenciación de cepas de ratón o investigadores. Etiquetas de oído pueden hacerse de metal o de plástico.
- Seleccione las etiquetas de oído apropiadas para los animales a identificar. Hay varios estilos de aplicadores disponibles de fabricantes de etiquetas del oído. Ser seguro para el aplicador que es para el tamaño y el estilo de etiquetas del oído se utilizan.
- Suavemente quitar una etiqueta del soporte del cartón y Oriente en el aplicador de manera que el extremo con el orificio se coloca sobre la zona dentada del aplicador. El extremo puntiagudo de la etiqueta debe ser enfrente de la ranura.
- Refrenar el animal para que las orejas son fácilmente accesibles. Los animales pueden ser menos propensos a luchar si los miembros posteriores puede descansar sobre una superficie, como una jaula o un contador.
- Coloque correctamente la etiqueta de oído para la colocación.
- Coloque el punto de la etiqueta de oído como profundamente en la concha de la oreja como sea posible, así que la etiqueta números cara la parte posterior del animal.
- Para que los números de etiqueta de oreja hacia la nariz del animal, coloque el punto de la etiqueta en la base de la oreja en la parte posterior de la oreja.
- Aplicar la etiqueta.
- Apriete firmemente el aplicador cerrado. La etiqueta de oído penetrarán en el oído y el bloqueo juntos.
- Suelte el aplicador y el oído etiquetado caerá fuera del aplicador.
Figura 2. Un ratón con un arete que esté colocado correctamente en la oreja.
- Retire las etiquetas de oreja metal.
Nota: en ocasiones, marcas auriculares metal pueden causar irritación e hinchazón del oído. La hinchazón y la irritación a menudo conduce a infecciones de la oreja. El tratamiento debe incluir la eliminación de la etiqueta; sin embargo, en casos de infección o irritación severa, el animal deba ser anestesiada.- Retire los residuos de alrededor de la etiqueta con un aplicador con punta de algodón humedecido con una solución antiséptica.
- Corte en la parte superior del bucle etiqueta de borde a borde con cortador de alambre. No corte a través de la superficie plana, ya que esto comprime la etiqueta, pellizcar la oreja y causar más daño.
- Evite aplicar torsión durante el corte para evitar desgarro del oído.
- Use pinzas hemostáticas para distribuir los extremos cortados de la etiqueta de oído aparte.
- Guie la etiqueta de oído a través de- y del oído mediante un hemostato. Reducir el trauma por evitar la ampliación del agujero del piercing y deslizamiento de la etiqueta hacia fuera para que el extremo engastado no pasa a través del oído.
- Una vez que se ha ido la etiqueta, limpie la oreja con un bastoncillo de algodón empapado en antiséptico.
- Si hay una secreción purulenta del oído, tratamiento de seguimiento puede ser necesario y se recomienda consultar con el personal veterinario para la evaluación.
Correcta identificación de los animales de laboratorio es un requisito fundamental de la investigación biomédica. Es esencial para los investigadores ser capaces de distinguir entre animales individuales para que el animal correcto se utiliza para la recolección de datos y procedimientos experimentales. Los científicos han desarrollado varios métodos permanentes y temporales para identificar a los animales de laboratorio individual. Aquí, vamos a discutir los dos métodos más utilizados: oído marcado y perforación de oído.
Antes de adentrarnos en el procedimiento para la perforación de oído, vamos a introducir el código de golpe de oído, los tipos de golpes disponibles y discutir las ventajas y desventajas de este método. Como puede haber adivinado, oído perforación consiste en perforar un agujero o una muesca en el oído externo o pabellón de la oreja del animal. Con el fin de estandarizar este método, se han desarrollado códigos de perforación de oído universal.
Dependiendo de la posición, las muescas en la oreja derecha representan dígitos individuales, como 1, 3 y 5, y una doble muesca representa 2. Utilizando diferentes combinaciones de estas muescas y resumir el valor de cada muesca, puede etiquetar el animal del 1 al 9. Del mismo modo, en la oreja izquierda, las mismas muescas representan las decenas. Y otra vez, diferentes combinaciones entre 10 y 90. Agujeros en el centro del pabellón de la oreja derecha e izquierda representan 100 y 200, respectivamente. Y los agujeros en ambos indican 300. Por lo tanto, por ejemplo, si desea etiquetar el animal 173, debeis hacer un agujero en el centro de la oreja derecha por 100, tres muescas en el izquierdo año sumando el total a 70 y una sola muesca en la oreja derecha superior que representa el lugar de la unidad "tres".
Ahora, vamos a discutir los tres estilos de golpes oído disponibles comercialmente: el golpe de tijera, el golpe de pulgar y el golpe de palanca. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas.
El golpe de pulgar requiere un movimiento de pellizco, pero es lo suficientemente pequeño como para caber en un tubo Eppendorf para que el tejido del oído puede recogerse más fácilmente. Ergonómicamente, el golpe de palanca es más fácil de usar que el golpe de pulgar, especialmente para los oídos más gruesos de las ratas más viejas. El golpe de tijera no requiere un movimiento de pellizco, evitando lesiones y fatiga de túnel carpiano.
A pesar de ser un método rápido y simple de la identificación, perforación del oído tienen algunas limitaciones. En primer lugar, el código de perforación de oído mencionado tiene un límite máximo de 399, que puede limitar el uso de este método en algunos estudios a gran escala. Otra limitación es que la mayoría de los animales debe ser captada en el pescuezo para leer el código, aumentando los tiempos se manejan. Como la edad, la piel de las orejas del ratas espesa y resulta difícil realizar golpe de oído sin causar señal de socorro considerable a los animales. Por lo tanto, es mejor realizar los golpes de oído en ratas jóvenes como ellos son destetados. Para ratas adultas que requieren identificación, se debe considerar el uso de inhalante anestesia cuando se realizan golpes de oído.
Ahora que tiene alguna información sobre el oído golpear código y los tipos de herramientas disponibles, vamos a aprender a realizar esta técnica en ratones.
Antes de iniciar el procedimiento, se recomienda que de perforación herramientas limpiar con una solución desinfectante, enjuagar con alcohol y secarse minuciosamente. Evite autoclave golpea el oído, ya que eventualmente los opacarán.
Para empezar, decidir código experimental del animal y el punzón que se utilizará. Vamos a usar el código 173 y tijera punzón como ejemplos aquí. El mismo procedimiento es aplicable a cualquier otro código o punzón. Cuando estés listo, refrenar el animal sujetando en el pescuezo para que las orejas son fácilmente accesibles. Comience con el agujero para 100. Poner la oreja derecha en el golpe que el agujero del sacador se coloca fuera del margen del pabellón de la oreja. A continuación, aplique presión para cerrar la tijera rápida y firmemente para cortar a través de la piel. A continuación, suelte el golpe y quitárselo de la oreja. Evite tirar o torcer el golpe para evitar desgarro del oído. Para hacer una muesca, colocar el punzón en el borde de la oreja del oído en el lugar correcto, en este caso en la parte superior de la oreja derecha para el "tres" en lugar de la unidad del código y hacer lo mismo - aplique presión firme y rápida y luego abrir la tijera para quitar. Repita el mismo procedimiento en la otra oreja para perforar tres muescas - dos por "20" cerca de la esquina exterior y uno para "50" cerca de la esquina interior, totalizando el código a "70".
Confirmar que el código correcto fue perforado antes de agregar la espalda animal a la jaula. Otra vez, limpiar el punzón con un desinfectante con alcohol y seque bien para evitar que se oxiden.
Ahora, pasemos a oído marcado, que es otro método barato y fácil de realizar para la identificación de los ratones y ratas. Hay una gran variedad de marcas auriculares disponibles en el mercado. Estos incluyen: metal etiquetas que tienen una serie de números y letras grabados en ellos y etiquetas de plástico con caracteres o códigos de barras en colores brillantes antecedentes.
Una desventaja de las etiquetas de metal es que a menudo es necesario recoger el animal para leer el código. En contraste, etiquetas de plástico son fáciles de leer sin tener que manejar los animales. Otra ventaja de etiquetas de plástico es su compatibilidad con la proyección de imagen de MRI. Mientras que las etiquetas proporcionan un identificador individual para un ratón o una rata, no son infalibles. Tags pueden ser perdidos debido a exceso de la preparación, dermatitis o infección, uno mismo-trauma infligido tratando de quitar las etiquetas debido a la intolerancia, lucha y comportamiento reproductivo agresivo. Si varios animales están alojados en la misma jaula, la pérdida de un arete puede ser problemática. Para evitar este problema, debe utilizarse una forma secundaria de identificación como un código de golpe en el oído del lado opuesto de la etiqueta. Una instalación debe estandarizar la opción del oído para ser etiquetados y el código para ser utilizado en la otra oreja, y todos los códigos se indicarán en la tarjeta de la jaula.
Ahora vamos a aprender cómo aplicar correctamente un arete, colocación incorrecta puede tener varias consecuencias desafortunadas. Tras aplicación, también vamos a discutir eliminación de la etiqueta de oído, que se realiza generalmente en el caso de una infección debido a la aplicación de la etiqueta.
El primer paso es seleccionar una etiqueta apropiada para los animales a identificar. Aquí, vamos a utilizar una etiqueta de metal para demostrar el procedimiento en ratones. Asegúrese de pedir el aplicador apropiado para el tamaño y el estilo de etiquetas del oído se utilizan. Suavemente Retire la etiqueta del cartón soporte y Oriente en el aplicador de manera que el extremo con el orificio se coloca sobre la zona dentada del aplicador. El extremo puntiagudo de la etiqueta debe ser enfrente de la ranura.
Cuando esté listo para aplicar la etiqueta de oído, refrenar el animal para que las orejas son fácilmente accesibles. Los animales pueden ser menos propensos a luchar si los miembros posteriores puede descansar sobre una superficie como la parte superior de la jaula o una encimera. Una vez que el animal es inmovilizado, la posición del punto de la etiqueta de oído profundamente en la concha de la oreja por lo números de la etiqueta de cara la parte posterior del animal. Luego, apriete firmemente el aplicador cerrado; la etiqueta de oído penetrarán en el oído y el bloqueo juntos. Cuando usted suelta, la oreja etiquetada caerá fuera del aplicador. Confirmar que la etiqueta ha sido correctamente posicionada y aplicado. Si prefiere tener los números de etiqueta de oreja hacia la nariz del animal, coloque el punto de la etiqueta en la base de la oreja en la parte posterior de la oreja y luego apriete para fijar la etiqueta en su lugar.
Etiquetas deben colocarse de tal manera que no causa una curva en el oído, interferir en la movilidad del animal o atorarse en alguna pieza de la jaula. Si la etiqueta se coloca demasiado cerca del borde de la oreja, se puede fácilmente rasgar. Si está situado demasiado cerca a la cabeza, la piel de la zona del cuello puede coger en la etiqueta, crear irritación, dolor y movimiento restringido, que puede conducir a uno mismo-trauma. De vez en cuando, etiquetas de metal pueden causar irritación e hinchazón del oído. Esto a menudo conduce a infecciones de la oreja, y el tratamiento inmediato debe incluir la eliminación de la etiqueta.
Para quitar la etiqueta, humedezca un aplicador con punta de algodón con una solución antiséptica y usarlo para eliminar cualquier suciedad de alrededor de la etiqueta. En casos severos de infección, el animal deba ser anestesiada. Luego, con cortadores de alambre, corte en la parte superior del bucle etiqueta de borde a borde. Lo importante, no atraviesan la superficie plana como comprimirá la etiqueta, pellizcar la oreja y causar daños en el oído. Utilizando pinzas hemostáticas, guie el arete a través y fuera del oído. Coloque la etiqueta hacia fuera para que el extremo engastado no pasa por que causa trauma y ampliación del agujero del piercing. Una vez que se ha ido la etiqueta, limpie la oreja con un palillo de algodón empapado antiséptico-aplicador y devolver el animal a su jaula. Si hay una secreción purulenta del oído, tratamiento de seguimiento puede ser necesario y se recomienda consultar con el personal veterinario para la evaluación.
Ahora que sabes cómo marcar los animales de laboratorio utilizando punzones y marcas auriculares, vamos a revisar algunas experiencias en que estos métodos pueden ser útiles. Una ventaja importante de usar código de perforación del oído es que los golpes pueden duplicar como muestras de tejido para genotipificación, reduciendo así el estrés a los animales causados por manipulación repetida. Sin embargo, si usted planea usar los golpes para recoger muestras de PCR, recuerde primero sumerja el aparato en una superficie solución descontaminante durante al menos 3 minutos eliminar el DNA o el RNA residual y luego enjuague con alcohol antes de usar.
Importancia de la técnica de identificación aumenta aún más si el experimento es duradero durante varios días. Por ejemplo, en este experimento los científicos primero etiquetado los animales usando una etiqueta de metal y luego inyecta el nervio ciático con una suspensión de células de tumor transgénicos que expresan la proteína luciferase. A continuación, para cuantificar la progresión del cáncer, reflejada los animales con bioluminiscencia en uno, diez y dieciocho días después de la inyección.
Usted sólo ha visto presentación de Zeus demostrando los dos comúnmente utilizados métodos de identificación en roedores: etiquetas del oído y oído golpes. Ahora debería entender el oído golpear código, conocer los diferentes tipos de etiquetas de oreja roedores disponibles en el mercado y deben ser capaces de realizar con precisión estos procedimientos sin causar malestar significativo de animales.
Recuerde, cada técnica tiene sus ventajas y desventajas, que deben ser consideradas en relación con sus necesidades experimentales. Además de considerar el costo, la facilidad de la técnica y el nivel de dolor a los animales deben ser algunas de las principales consideraciones al elegir el método de identificación. ¡Como siempre, gracias por ver!
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Al elegir el método de identificación, muchos factores deben ser deliberados. Cada técnica tiene ventajas y desventajas que deben ser considerados en relación con las necesidades experimentales. Mientras que los costos deben ser sopesados junto con otros factores, la facilidad de la técnica y el nivel de molestias a los animales deben ser las consideraciones primarias. 3, 4
Perforación/muescas de oreja es de uso general en ratones y ratas porque hay un costo mínimo y el procedimiento es fácil de hacer. Hay un número limitado de códigos que pueden utilizarse con la mayoría de los códigos tiene un límite superior de 100 a 399. Para leer los códigos de perforación de oreja, mayoría de los animales debe ser comprendida en el pescuezo. Sin embargo, los golpes pueden duplicar como muestras de tejido para la genotipificación de la PCR, que permite la identificación y muestreo de genotipo que se logrará al mismo tiempo, lo que resulta en menos estrés a los animales de la manipulación repetida. 5
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References
- Robinson, V., Morton, D.B., Anderson, D., Carver, J.F.A., Francis R.J., Hubrecht, R., Jenkins, E., Mathers, K.E., Raymond, R., Rosewell, I., Wallace, J., and Wells, D.J. 2003. Refinement and reduction in production of genetically modified mice. Laboratory Animals. 37:S1-S50.
- Cover, C.E., Keenan, C.M., and Bettinger, G.E. 1989. Ear tag-induced Staphylococcus infection in mice. Laboratory Animals. 23:229-233.
- Kitagaki, M., Suwa, T., Yanagi, K., and Shiratori, K. 2003. Auricle chondritis in young ear-tagged Crj:CD(SD)IGS rats. Laboratory Animals. 37:249-253.
- Kasanen, H.E., Voipio, H.M., Leskinen, H., Luodonpää, M., and Nevalainen, T.O. 2011. Comparison of ear tattoo, ear notch and microtattoo in rats undergoing cardiovascular telemetry. Laboratory Animals. 45:154-159.
- Dalhborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., and Spangenberg, E. 2013. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Laboratory Animals. 47:2-11.
- Waalkes, M.P., Rehm, S., Kasprzak, K.S., et al. 1987. Inflammatory, proliferative, and neoplastic lesions at the site of metallic identification ear tags in Wistar [Crl:(WI)BR] rats. Cancer Research. 47:2445-2450.
