Overview
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מפגין מחבר: אלכס ווסימי
וירוסים הם קבוצה ייחודית של ישויות ביולוגיות המדביקות הן אורגניזמים אאוקריוטים והן אורגניזמים פרוקריוטים. הם טפילים מחייבים שאין להם יכולת מטבולית, וכדי לשכפל, להסתמך על חילוף החומרים המארח לייצר חלקים ויראליים כי הרכבה עצמית בתוך תאים מארחים.
וירוסים הם אולטרה מיקרוסקופיים – קטנים מכדי שניתן לצפותם במיקרוסקופ האור, הנראים רק ברזולוציה גדולה יותר של מיקרוסקופ האלקטרונים. חלקיק נגיפי מורכב מגנום חומצת גרעין, DNA או RNA, מוקף במעיל חלבון, המכונה קבסיד, המורכב מתת-units חלבון או קאפסומרים. בכמה וירוסים מורכבים יותר, capsid מוקף במעטפה שומנים נוספת, וחלקם יש נספחי משטח דמוי ספייק או זנבות.
וירוסים המדביקים את מערכת העיכול של בני אדם ובעלי חיים ידועים בשם וירוסים אנטריים. הם מופרשים בצואה וניתן לבודד אותם ממי שפכים מקומיים. וירוסים שמדביקים חיידקים ידועים בשם בקטריופאג'ים, ואלה שמדביקים חיידקים קוליפורמיים נקראיםקוליפג'ים (איור 1). הפאג'ים של חיידקי קוליפורם נמצאים בכל מקום בו נמצאים חיידקי קוליפורם.
איור 1. קוליפייג' טי-2.
Principles
בקטריופאג'ים נחקרים במדעי הסביבה משום שהם מרכיב קריטי במערכות ביולוגיות. הם הישות הביולוגית הנפוצה ביותר על פני כדור הארץ והם חשובים כי הם עוזרים לשלוט באוכלוסיות חיידקים, תהליכי אינטרנט מזון, מחזורים ביו-גיאוכימיים, כמו גם לשפר את המגוון הפרוקריוטי באמצעות העברת גנים אופקית. יש גם ראיות לכך שפאג'ים הם אינדיקטורים פונדקאיים אמינים לווירוסים אנטריים הגורמים למחלות שגם הם מועברים בצואה אך קשה לבדיקה. הזמינות של שיטות מהירות וזולות יחסית לספירת בקטריופאג'ים הופכת אותם לכלי אטרקטיבי להערכת זיהום צואה בדגימות סביבתיות.
קוליפאגים במים ננזפים על ידי תוספת של מדגם לאגר רך או כיסוי יחד עם תרבות של E. coli בשלב היומן של הצמיחה. הפאג' מתחבר לתא החיידקי ומפיץ את החיידקים. החיידקים מייצרים מדשאה מכנסת של צמיחה למעט אזורים שבהם הפאג' גדל והפך את החיידקים. אזורים ברורים אלה וכתוצאה מכך ידועים בשם לוחות. שכבת אגר רכה משמשת להגבלת הדיפוזיה הפיזית של הנגיפים, כך שעם היציאה מחיידק, הם יכולים להתפשט רק לתאי חיידקים שכנים.
כדי להשיג היווצרות פלאק אופטימלית חשוב שהחיידקים המארחים ישנים בשלב היומן של הצמיחה. זה מבטיח שכל הפאג' יתחבר לחיידקים חיים וייצור צאצאים. זה דורש שתרבית של חיידקים מארחים תהיה מוכנה בכל יום כי בדיקת בוצעה. בדרך כלל, תרבות היא דגירה יום לפני ההסתה כך שזה יהיה בשלב נייח. ביום ההסתה, התרבות משמשת לחסן מרק, אשר דגירה כדי להשיג מספיק חיידקים מארח בשלב העץ עבור assay (זה בדרך כלל דורש 2-3 שעות של דגירה באמבט מים רועד ב 35-37 °C (37 מעלות צלזיוס).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
- להשיג מדגם של ביוב או מים המכילים קוליפייג '.
- לדלל את המדגם 1: 10 ו 1: 100 באמצעות מאגר טריס. עשה זאת על-ידי העברת 1.0 מ"ל של תרבות ל- 9 מ"ל של חיץ טריס, ולאחר מכן ביצוע דילול כפול שני.
- ממיסים שלושה צינורות של אגר רך (0.7% אגר או אגר סויה טריפטיאז לכל צינור 3 מ"ל) על ידי הצבתם באמבט אדים או אוטוקלבה.
- מניחים את אגר באמבט מים ב 45-48 °C (55 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר את הטמפרטורה של אגר כדי להתאים ל 45 °C (5 °F).
- לצינור הראשון, להוסיף 1 מ"ל של תרבות מרק שלב בול עץ של E. coli1 ו 1 מ"ל של מדגם לא מדולל.
- מוציאים את הצינור מאמבט המים ומנענעים בעדינות בין הידיים כדי לערבב את המתלים במשך 2-3 s.
- לנגב את המים מן הצינור עם מגבת נייר ויוצקים את אגר על צלחת פטרי שהוכן בעבר המכיל אגר תחתון (אגר מיזים רגיל או אגר סויה טריפטיאז).
- סובב במהירות את הצלחת כדי לפזר את אגר העליון. תוודא שהאג מכסה את כל פני השטח.
- חזור על שלבים 5-8 עם שני הצינורות האחרים של אגר רך, באמצעות 1 מ"ל של חיידקים ו 1 מ"ל של כל דילול מדגם(איור 2).
- לאחר שהאג מתמצק, הפוך את מנות הפטרי ודגר ב 37 °C (48 שעות). תורידו כל לחות מהמכסה של צלחת הפטרי. אם טיפת לחות נופלת על לוח זה יגרום הנגיף להתפשט על פני אגר.
- לאחר הדגירה, ספרו את מספר הלוחות על כל דילול(איור 3)וחשבו את ריכוז הפאג' במדגם המקורי. תיעדו הבדלים משמעותיים בגודל או במראה של הלוחות.
איור 2. הליך להכנת מדשאה חיידקית באמצעות אגר עליון לספירת קוליפייג'.
איור 3. לוחות פאג' על מדשאה חיידקית.
1E. זן קולי ATCC 15597 בדרך כלל יפיק את המספר הגדול ביותר של לוחות מדגימות ביוב. זה צריך להיות גדל לילה בקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ודגרה בתנאים רועדים ב 35 °C .3 שעות לפני חיטוי phage לחסן mL אחד של תרבות זו לתוך בקבוקון טרי המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ומניחים באמבט מים רועד ב 35-37 °C (35°F). זה יבטיח שהחיידקים נמצאים בשלב היומן של הצמיחה.
וירוסים הם חלקיקים ביולוגיים זיהומיים האחראים למחלות רבות, הצטננות ושפעת, להפטיטיס ו- HIV.
וירוסים הם חלקיקים ביולוגיים המורכבים מדנ"א או מגנום RNA, עטופים בתוך מעיל חלבון המכונה קבסיד, לפעמים עם מעטפת שומנים נוספת. לווירוסים אין יכולת מטבולית או רבייה בעצמם, והם חייבים לפלוש לתאים חיים ולחטוף את המכונות התאיות שלהם כדי ליצור עותקים נוספים של עצמם.
שני תאים פרוקריוטים, כגון חיידקים, ותאים אאוקריוטים, כגון אלה של בני אדם, יכולים להיות נגועים על ידי סוגים מסוימים של וירוסים. באופן ספציפי, בקטריופאג'ים הם וירוסים שמדביקים חיידקים. לדוגמה, קוליפלגים הם אותם פאג'ים שמדביקים את E. coli, חיידק מעיים נפוץ, כמה זנים אשר יכול לגרום להרעלת מזון, וזה אינדיקציה של זיהום צואה של אספקת המים.
בעוד פאג'ים עצמם אינם ידועים בדרך כלל להיות פתוגניים בבני אדם, יש ראיות כי הם אינדיקטורים פונדקאיים אמינים עבור enteroviruses גורם למחלות כי הם גם מועברים בצואה אבל קשה לאיד. הזמינות של שיטות מהירות וזולות יחסית לספירת בקטריופאג'ים הופכת אותם לכלי אטרקטיבי להערכת זיהום צואה בדגימות סביבתיות.
סרטון זה יציג את העקרונות שמאחורי 2008; להדגים פרוטוקול לכימות פאג'ים, המכונה פלאק אסאי; ולבסוף, לחקור מספר יישומים מדעיים סביבתיים לגילוי וספירה של פאג'ים ווירוסים אחרים.
בקטריופאג'ים, כמו כל הווירוסים, חייבים לטפטפן תאים חיים, במקרה זה חיידקים, כדי להתרבות.
פאג'ים עושים זאת על ידי נחיתה וחיבור לפני השטח של תאי החיידקים והזרקת החומרים הגנטיים שלהם לתא. ברגע שהוא בתוך התא, הגנום הנגיפי משוכפל ורכיבי החלבון של הקפסיד הנגיפי מיוצרים, שניהם באמצעות המכונות הביוכימיות של התא המארח. ברגע שחלקיקי הפאג' מורכבים, הם משתחררים מהחיידקים, לעתים קרובות על ידי ליסינג הפונדקאי והתפרצות החוצה, והורגים את התא המארח בתהליך.
שיטה נפוצה לקביעת ריכוז פאג ' במדגם מנצלת פעילות ליטית זו. בטכניקה זו, הפאג' מהדגימה מעורבב עם חיידקים ואגר רך. תערובת זו נשפכת על מנות פטרי עם אגר רגיל כמצע, והשכבה העליונה יוצרת שכבת-על.
החיידקים נמצאים בריכוז כה גבוה שהם יוצרים מדשאה רציפה. החיידקים צריכים להיות מושגת מתרבות שנמצאת בשלב היומן של הצמיחה, כדי להבטיח שכל חיידק שהפאג'ים מדביקים חי ומאפשר לפאג' לייצר צאצאים.
כאשר חלקיק פאג' מדביק ומדביק חיידק, צאצאי הפאג' יתפשטו לתאי חיידקים סמוכים וימשיכו את הזיהום. אגר רך מגביל את הדיפוזיה של חלקיקי הפאג '. בסופו של דבר, ייווצר אזור של סליקה, המכונה לוח.
אם הפאג' מדולל לריכוז נמוך מספיק, אז ניתן לצפות בלוחות נפרדים ובודדים על הדשא החיידקי. אלה ניתן לספור ולהשתמש בהם כדי לחשב את מספר יחידות יוצרות פלאק, או PFUs, של פאג ' לכל mL של המדגם המקורי.
עכשיו, כשתבינו איך פאג'ים מדביקים חיידקים ואיך אפשר להשתמש בפעילות זו כדי למדוד ריכוז פאג', בואו נעבור על פרוטוקול לשימוש ב-plaque assay כדי למנות פאג'ים בדגימות מים סביבתיות.
יום אחד לפני ביצוע ההבחנה, לחסן מושבה של זן E. coli ATCC 15597 לתוך 100 מ"ל של ציר סויה טריפטיאז בבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל. לדגור אותו עם רועד ב 35 °C (5 °F) לילה.
3 שעות לפני ההסתערות, לחסן 1 מ"ל של תרבות E. coli לילה לתוך 100 מ"ל טרי של מרק. מניחים את התרבות החדשה הזו באמבט מים רועד בטמפרטורה שבין 35 ל -37 מעלות צלזיוס. זה מבטיח שהחיידקים נמצאים בשלב היומן של הצמיחה כאשר בדיקת הישבן מתחילה.
כדי להתחיל את בדיקת הפלאק, הכינו דילול טורי של פי 10 ו-100 מדגם המים, באמצעות 9 מ"ל של חיץ טריס.
באמצעות אמבט אדים, להמיס שלושה צינורות 5 מ"ל של אגר העליון 0.7% רך, או טריפטיאז סויה או אגר מיזיני. לאחר נמס, מניחים באמבט מים ב 45 עד 48 °C (5 °F) לפחות 15 דקות עבור טמפרטורת אגר לרדת ל 45 °C (5 °F).
לצינור הראשון של אגר רך, להוסיף 1 מ"ל של תרבות E. coli שלב יומן שהוכן בעבר ו 1 מ"ל של דגימת מים לא מדוללת. הסר את הצינור מאמבט המים וסלע בעדינות בין הידיים במשך 2-3 s לערבב את ההשעיה.
יוצקים את אגר רך על צלחת פטרי שהוכן בעבר עם סויה טריפטיאז או אגר מיזים. סובב במהירות את הצלחת כדי להתפשט, ודא שהוא מכסה את כל פני השטח.
חזור על החיסון והפיפה עבור שני הצינורות האחרים, באמצעות 1 מ"ל של כל אחת מהדגימות המדוללות.
לאחר agar העליון התגבש, הפוך את הכלים ודגור אותם ב 37 °C (48 שעות).
לאחר הדגירה, לספור את מספר המכות על כל צלחת. לפי הספירה, חשב את ריכוז הפאג' במדגם המקורי
לדוגמה, אם 9 לוחות התקבלו מצלחת דילול פי 10, אז יש 9 פעמים 10 חלקי 1 מ"ל, או 90 PFUs / mL של קוליפלג בדגימת המים המקורית.
עכשיו שראיתם איך מבוצעות מבאיות פלאק פאג', בואו נסתכל איך ניתן להשתמש בבדינות פלאק כדי למנות פאג' וסוגים אחרים של וירוסים ממגוון מקורות.
ניתן להשתמש בשיטות מבוססות בדיקות פלאק כדי לבודד בקטריופאג' מדגימות סביבתיות שונות כגון אדמה. בדוגמה זו, החוקרים אספו לראשונה פאג' מהאדמה על ידי סינון. הפאג' שימש אז להדבקת חיידקי הקרקע הנפוצים ארתרובקטריה בחקירה פלאק. פאג'ים נקטפו מלוחות בודדים ועברו על לוחות אגר חדשים, ולאחר מכן היו עמוסים באגר עליון המכיל חיידקים. ריכוז הפאג' פוחת לאורך הרצף, כך שניתן להשיג לוחות נפרדים, שנוצרו ככל הנראה על ידי סוג אחד של פאג '. לאחר מכן ניתן היה לבחור את הלוחות הבודדים האלה כדי לנתח עוד יותר את הפאג'ים שבתוכם.
בנוסף לבקטריופאג'ים, בדיקות פלאק יכולות להתבצע גם עם וירוסים אחרים, כולל אלה, כגון שפעת, שמדביקים יונקים. כדי לעשות זאת, תאים יונקים גדלים לראשונה כמו monolayers בצלחות תרבית רקמות. מדיה המכילה את הווירוסים מתווספים לאחר מכן לתאים כדי לאפשר זיהום להתרחש, לפני התאים הם overlaied עם מדיום משתקת כגון אגרוז דמוי ג'ל. לאחר תקופת דגירה שיכולה להימשך עד שבועיים, התאים הנגועים קבועים ומוכתמים כדי לאפשר את הפלאק להיות חזותי ונספר.
לבסוף, בנוסף לדגימות שנאספו מהסביבה, בדיקות פלאק שימושיות לאיתור והספירה של וירוסים בדגימות רקמה מאנשים נגועים. כאן, החוקרים השיגו והומוגניזציה רקמות ריאות מעכברים נגועים גמא הרפסוירוסים. הומוגנט המכיל וירוסים זה שימש אז להדבקת תרבית תאי היונקים. לאחר מכן ניתן לספור את מספר הלוחות כדי לספק הערכה לטיטר הנגיפי ברקמות הריאה הנגועות.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על זיהוי בקטריופאג'ים בדגימות סביבתיות. עכשיו אתה צריך להבין את הביולוגיה הבסיסית של פאג'ים, איך לבצע בדיקות פלאק כדי כמות פאג'ים במדגם סביבתי, וכיצד בדיקות פלאק ניתן להשתמש כדי ללמוד פאג 'ווירוסים אחרים בדגימות סביבתיות או קליניות. כמו תמיד, תודה שצפית!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
דילול דגימת ביוב = 10-1
מספר הלוחות שהושגו = 9
לכן, ריכוז פאג' בדגימת ביוב
= 10 x 9 ÷ 1 מ"ל
= 90 יחידות יוצרות פלאק / מ"ל
ביוב גולמי מכיל בדרך כלל 103 - 104 קוליפייג ' למ"ל, עם טווח של 102 – 108 למ"ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
ישנם יישומים פוטנציאליים רבים של coliphages כאינדיקטורים סביבתיים. אלה כוללים את השימוש בהם כאינדיקטורים לזיהום ביוב, יעילות הטיפול במים ושפכים, והישרדות של וירוסים וחיידקים אנטריים בסביבה. השימוש בבקטריופאג'ים כאינדיקטורים לנוכחותם והתנהגותם של חיידקים אנטריים ווירוסים מן החי תמיד היה אטרקטיבי בגלל קלות הזיהוי והעלות הנמוכה הקשורה בבדיקות פאג '. בנוסף, ניתן לכמתם בדגימות סביבתיות בתוך 24 שעות בהשוואה לימים או שבועות לווירוסים אנטריים.
1E. זן קולי ATCC 15597 בדרך כלל יפיק את המספר הגדול ביותר של לוחות מדגימות ביוב. זה צריך להיות גדל לילה בקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ודגרה בתנאים רועדים ב 35 °C .3 שעות לפני חיטוי phage לחסן mL אחד של תרבות זו לתוך בקבוקון טרי המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ומניחים באמבט מים רועד ב 35-37 °C (35°F). זה יבטיח שהחיידקים נמצאים בשלב היומן של הצמיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
