Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Erkennung von Bakteriophagen in Umweltproben

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Viren sind infektiöse biologische Partikel, die verantwortlich für viele Krankheiten, Erkältung und Grippe, Hepatitis und HIV.

Viren sind biologische Partikel bestehend aus DNA oder RNA-Genom, gewickelt in einer Protein-Mantel bekannt als ein Kapsid, manchmal mit einem zusätzlichen Lipid Umschlag. Viren müssen haben keine metabolische oder reproduktive Fähigkeit auf eigene Faust, und dringen in lebenden Zellen und entführen ihre zellulären Maschinerie um weitere Kopien von sich selbst machen.

Prokaryotische Zellen, wie Bakterien, und eukaryotischen Zellen, wie die des Menschen, können durch bestimmte Klassen von Viren infiziert werden. Insbesondere sind Bakteriophagen Viren, die Bakterien infizieren. Coliphages sind beispielsweise die Phagen, die E. Coli, einem gemeinsamen Darm-Bakterium infizieren, manche Virusstämme Lebensmittelvergiftung verursachen können, und das ist ein Indikator für fäkale Verunreinigung des zufließenden Wassers.

Während Phagen sich nicht allgemein bekannt sind, beim Menschen pathogen sein, gibt es Hinweise darauf, dass sie zuverlässige Surrogat Indikatoren für die krankheitsverursachenden sind Enteroviren, die auch fecally übertragen werden-aber schwer zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von relativ schnelle und kostengünstige Methoden zum Auflisten von Bakteriophagen macht ihnen ein attraktives Instrument für die Beurteilung der fäkale Verunreinigungen in Umweltproben.

Dieses Video wird die Prinzipien hinter Phagen-Enumeration einzuführen; zeigen Sie ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagen, bekannt als die Plaque-Assay; und zu guter Letzt erkunden Sie mehrere Umweltwissenschaften-Anwendungen für den Nachweis und Zählung der Phagen und andere Viren.

Bakteriophagen, wie alle Viren müssen lebende Zellen, in diesem Fall Bakterien, parasitieren, um sich zu vermehren.

Phagen dazu landen und Anfügen an die Oberfläche der Bakterienzelle und injiziert ihr genetisches Material in die Zelle. Einmal innerhalb der Zelle das virale Genom repliziert wird und die Eiweißbausteinen der viralen Kapsid produziert werden, beide unter Verwendung von biochemischen Maschinerie der Wirtszelle. Sobald die Phagen Partikel montiert sind, sind sie von den Bakterien oft veröffentlicht durch Lyse des Hosts und platzen, in den Prozess die Wirtszelle zu töten.

Eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Phagen-Konzentration in einer Probe nutzt diese lytische Aktivität. Bei dieser Technik wird das Bakterium aus der Probe mit Bakterien und weiche Agar vermischt. Diese Mischung wird auf Petrischalen mit regelmäßigen Agar ein Substrat und die oberste Schicht bildet eine Überlagerung gegossen.

Die Bakterien sind in einer hohen Konzentration, dass sie einen kontinuierliche Rasen bilden. Die Bakterien erhalten Sie vom Kultur, die in der Log-Phase des Wachstums, um sicherzustellen, dass jedes Bakterium, die die Phagen zu infizieren lebendig ist und ermöglicht die Phagen, nachkommen zu produzieren.

Wenn ein Teilchen Phagen infiziert und lyses ein Bakterium, werden Phagen Nachkommen verbreitete sich in der Nähe von Bakterienzellen und die Infektion weiter. Die weiche Agar schränkt die Diffusion der Phagen Partikel. Schließlich wird eine Fläche von Clearing, bekannt als ein Plaque gebildet werden.

Wenn das Bakterium eine niedrig genug Konzentration verdünnt wird, können diskretere, individuelle Plaketten auf dem bakteriellen Rasen beobachtet werden. Diese können gezählt und verwendet, um die Anzahl der Plaque-Bildung von Einheiten oder PFUs des Phagen pro mL der ursprünglichen Probe zu berechnen.

Nun, Sie wissen wie Phagen Bakterien infizieren und wie diese Aktivität verwendet werden kann, um Phagen-Konzentration zu messen, gehen Sie wir durch ein Protokoll für die Verwendung eines Plaque-Assays Phagen in ökologischen Wasserproben auflisten.

Impfen Sie einen Tag vor der Durchführung der Test eine Kolonie von E. Coli -Stamm ATCC 15597 in 100 mL Trypticase-Soja-Brühe in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben. Inkubieren Sie es unter Schütteln bei 35 ° C über Nacht.

3 h vor der Assay impfen 1 mL der Nacht E. Coli Kultur in eine frische 100 mL Brühe. Legen Sie diese neue Kultur in einem schütteln Wasserbad bei einer Temperatur zwischen 35 und 37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums, sind wenn der Test beginnt.

Um die Plaque-Assay zu starten, machen Sie 10 und 100 fache Verdünnungsreihen der Wasserprobe, mit 9 mL Tris-Puffer.

Mit einem Dampfbad, Schmelzen Sie drei 5-mL-Röhrchen von 0,7 % weiche obere Agar, entweder Trypticase-Soja oder Nährstoff-Agar. Einmal geschmolzen, legen Sie in einem Wasserbad bei 45 bis 48 ° C für mindestens 15 min für die Agar Temperatur bis 45 ° c sinkt

Das erste Rohr weich Agar fügen Sie hinzu, 1 mL der vorbereiteten Log-Phase E. Coli Kultur und 1 mL der unverdünnten Wasserprobe. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und sanft Rock zwischen Ihren Händen für 2-3 s, die Aussetzung zu mischen.

Eine zuvor vorbereiteten Petrischale mit Trypticase-Soja oder Nährstoff-Agar übergießen Sie weichen Agar. Drehen Sie schnell die Platte zu verbreiten, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche bedeckt.

Wiederholen Sie die Impfung und Beschichtung für die anderen zwei Röhren, mit 1 mL einer verdünnten Proben.

Sobald die obere Agar erstarrt ist, invertieren Sie die Gerichte zu und inkubieren sie bei 37 ° C für 48 h.

Nach der Inkubation die Anzahl der Plagen auf jeder Platte. Berechnen Sie von der Zählung die Phagen-Konzentration in der Originalprobe

Zum Beispiel, wenn 9 Plaketten aus der 10-divisibel Verdünnung Platte gewonnen wurden, dann gibt es 9 mal 10 geteilt durch 1 mL oder 90 PFUs/mL des Coliphage in der ursprünglichen Wasserprobe.

Nun, Sie gesehen haben, wie PHAGEN-Plaque-Tests durchgeführt werden, schauen Sie sich bitte an die Verwendung von Plaque-Assays Phagen und andere Arten von Viren aus den unterschiedlichsten Quellen auflisten.

Plaque-Assay-basierte Methoden lässt sich die Bakteriophagen aus verschiedenen Umweltproben wie Boden zu isolieren. In diesem Beispiel gesammelt Forscher zuerst Phagen aus dem Boden durch Filtration. Die Phagen wurde dann verwendet, um die gemeinsamen Bodenbakterien Arthrobacter in einem Plaque-Assay zu infizieren. Phagen waren holte vom einzelnen Plaketten auf neue Agarplatten gestreift und dann mit Bakterien-haltigen obere Agar überlagert. Phagen-Konzentration sinkt entlang der Länge des Streifens damit diskrete Plaques, wahrscheinlich von einer einzigen Art von Phagen, gebildet erzielt werden könnte. Diese einzelnen Plaques könnte dann abgeholt werden, um die Phagen innerhalb weiter zu analysieren.

Plaque-Assays können zusätzlich Bakteriophagen auch mit anderen Viren, einschließlich derjenigen, wie Influenza, durchgeführt werden, die Säugetiere infizieren. Zu diesem Zweck sind Säugerzellen zunächst als Monolayer in Gewebekultur Gerichten erwachsen. Medien, die die Viren werden dann zu den Zellen zu ermöglichen-Infektion auftreten, bevor die Zellen mit einem fixierenden Medium wie die Gel-artige Agarose überlagert werden, hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit, die bis zu zwei Wochen dauern könnte, sind die infizierten Zellen fixiert und gefärbt, um die Plaketten, visualisiert und gezählt werden können.

Zu guter Letzt eignen sich neben Proben aus der Umgebung, Plaque-Assays für die Erkennung und Aufzählen von Viren in Gewebeproben von infizierten Personen. Hier, Forscher und homogenisierte Lungengewebe von Mäusen mit Gamma-Herpesviren infiziert. Dieser Virus-haltigen Homogenat wurde dann zur Säugetier-Zellkultur zu infizieren. Die Zahl der Plaketten könnte dann gezählt werden, um eine Schätzung für die virale Titer in den infizierten Lungengewebe zu bieten.

Sie haben nur Jupiters Video auf den Nachweis von Bakteriophagen in Umweltproben beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen die grundlegende Biologie des Phagen, wie einen Plaque-Assay zur Phagen in einer ökologischen Probe quantitate durchführen und Verwendung von Plaque-Assays Phagen und andere Viren in Umwelt- oder klinischen Proben zu untersuchen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter