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Detección de bacteriófagos en muestras ambientales
 

Detección de bacteriófagos en muestras ambientales

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Los virus son partículas biológicas infecciosas que son responsables de muchas enfermedades, el frío y la gripe, la hepatitis y el VIH.

Los virus son partículas biológicas consisten en un DNA o RNA genoma, envuelto dentro de una cubierta proteica denominada cápside, a veces con una envoltura de lípidos adicionales. Virus no tiene sus el propios, capacidad metabólica o reproductiva y deben invadir células vivas y secuestrar su maquinaria celular para hacer más copias de sí mismos.

Las células procariotas, como las bacterias y células eucariotas, como las de los seres humanos, pueden ser infectadas por clases específicas de virus. Específicamente, los bacteriófagos son virus que infectan bacterias. Por ejemplo, los colífagos son los fagos que infectan a e. coli, una bacteria común del intestino, algunas cepas que pueden causar intoxicación alimentaria, y que es una indicación de contaminación fecal en el suministro de agua.

Mientras que los fagos no se conocen generalmente a ser patógeno en seres humanos, existen evidencias que son indicadores de sustituto fiable para patógenos enterovirus también heces-transmitidos pero difícil de analizar. La disponibilidad de métodos relativamente rápidas y baratas para enumerar los bacteriófagos los hace una herramienta atractiva para la evaluación de contaminación fecal en muestras ambientales.

Este video presenta los principios detrás de enumeración de fagos; demostrar un protocolo para la cuantificación de phages, conocidos como el ensayo de placa; y por último, explorar varias aplicaciones de la ciencia ambiental para la detección y recuento de fagos y otros virus.

Bacteriófagos, como todos los virus, deben parasitar las células vivas, en este caso las bacterias, con el fin de reproducir.

Los phages hacen aterrizar y fijación a la superficie de la célula bacteriana e inyectar su material genético en la célula. Una vez dentro de la célula, el genoma viral se replica y se producen los componentes de la proteína de la cápside viral, ambos utilizando la maquinaria bioquímica de la célula huésped. Una vez que las partículas de fagos se ensamblan, se lanzan de las bacterias, a menudo por lisis del host y estalla, matando a la célula huésped en el proceso.

Un método ampliamente utilizado para la determinación de la concentración de fagos en una muestra aprovecha esta actividad lítica. En esta técnica, el phage de la muestra se mezcla con las bacterias y agar suave. Esta mezcla se vierte en placas de Petri con agar regular como un sustrato y las formas de la capa superior un recubrimiento.

Las bacterias son en una alta concentración que forman un césped permanente. La bacteria debe obtenerse de la cultura que está en la fase logarítmica de crecimiento, para asegurar que cada bacteria que infecta a los phages está viva y permite el phage producir progenie.

Cuando una partícula de fago infecta y descompone mediante lisis de una bacteria, la progenie del fago se extendió a cerca de las células bacterianas y continuar con la infección. El agar blando restringe la difusión de las partículas de fago. Finalmente, se formará una zona de claro, conocida como una placa.

Si el fago se diluye a una concentración lo suficientemente baja, las placas discretas, individuales pueden observarse en el césped bacteriano. Estos pueden ser contados y permite calcular el número de unidades formadoras de placa o PFUs de fagos por mL de la muestra original.

Ahora que usted entiende cómo fagos infectan a las bacterias y cómo esta actividad se puede utilizar para medir la concentración de fagos, vamos a ir a través de un protocolo para el uso de un ensayo de placa para enumerar los phages en muestras de agua ambiental.

Un día antes de realizar el ensayo, inocular una colonia de la cepa de e. coli ATCC 15597 en 100 mL de caldo de soja tripticasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Incubar con agitación a 35 ° C durante la noche.

3 h antes del ensayo, inocular 1 mL de la cultura de e. coli durante la noche en una fresca 100 mL de caldo. Coloque esta nueva cultura en un baño a una temperatura entre 35 y 37 ° C. Esto asegura que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento cuando el ensayo comienza.

Para iniciar el ensayo de placa, hacer 10 y 100 veces diluciones seriadas de la muestra de agua, con 9 mL de tampón Tris.

Utilizando un baño de vapor, derrita tres tubos 5 mL de agar superior suave del 0,7%, o agar trypticase de soja o de nutrientes. Una vez derretido, colocar en un baño de agua a 45 a 48 ° C durante al menos 15 min para que baje a 45 ° C. temperatura de agar

Al primer tubo de agar blando, añadir 1 mL de la fase logarítmica previamente preparada cultura de e. coli y 1 mL de la muestra de agua sin diluir. Retire el tubo del baño de agua y suavemente roca entre sus manos para 2-3 s mezclar la suspensión.

Verter el agar suave sobre una placa de Petri previamente preparado con agar trypticase de soja o nutrientes. Rápidamente gire la placa de la extensión, asegurándose de que cubra toda la superficie.

Repetir la inoculación y placas para los otros dos tubos, 1 ml de cada una de las muestras diluidas.

Una vez que se ha solidificado el agar superior, invertir los platos e incubar a 37 ° C durante 48 h.

Después de la incubación, cuente el número de plagas en cada plato. De la cuenta, calcular la concentración de fagos en la muestra original

Por ejemplo, si 9 placas se obtuvieron de la placa de la dilución de 10 veces, entonces hay 9 veces 10 dividido por 1 mL, o 90 PFUs/mL de colifago en la muestra original de agua.

Ahora que usted ha visto cómo se realizan los ensayos de placa de fago, echemos un vistazo a cómo ensayos de placa se pueden utilizar para enumerar los fagos y otros tipos de virus de una variedad de fuentes.

Método basado en el ensayo de placa se puede utilizar para aislar bacteriófago de diversas muestras ambientales como suelo. En este ejemplo, los investigadores primero recogen phage del suelo por filtración. El phage entonces fue utilizado para infectar a las bacterias comunes Arthrobacter del suelo en un ensayo de placa. Phages fueron recogidos de las placas individuales trata nuevas placas de agar y entonces overlaid con agar superior que contiene las bacterias. Concentración de fagos disminuye a lo largo de la longitud de la racha, de modo que pudieran obtenerse placas circunscritas, probablemente formadas por un solo tipo de fago. Estas placas individuales podrían ser recogidas entonces analizar los phages dentro.

Además de bacteriófagos, ensayos de placa también puede realizarse con otros virus, incluyendo aquellas que, como la gripe, que infecta a mamíferos. Para hacer esto, las células mamíferas son primero crecidas para arriba como monocapas en platos de cultivo de tejidos. Medios que contienen los virus se añaden a las células para permitir que la infección ocurra, antes de que las células son overlaid con un medio de inmovilización como la agarosa gelatinoso. Después de un período de incubación que puede durar hasta dos semanas, las células infectadas son fijo y teñidas para permitir que las placas ser visualizados y contado.

Finalmente, además de las muestras recogidas del medio ambiente, ensayos de placa son útiles para la detección y enumeración de virus en muestras de tejido de individuos infectados. Aquí, los investigadores obtuvieron y tejidos homogeneizados de pulmón de ratones infectaron con gamma-herpesvirus. Este homogeneizado que contiene el virus entonces fue utilizado para infectar cultivos celulares mamíferos. El número de placas entonces podría contarse proporcionar una estimación de la concentración viral en los tejidos pulmonares infectados.

Acabo de ver video de Zeus en la detección de bacteriófagos en muestras ambientales. Ahora debería entender la biología básica de phages, cómo realizar un ensayo de placa para cuantificar phages en una muestra ambiental y cómo se pueden utilizar ensayos de placa para el estudio de fagos y otros virus en muestras clínicas o ambientales. ¡Como siempre, gracias por ver!

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