Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Alex Wassimi
Los virus son un grupo de entidades biológicas que infectan a los organismos eucariotas y procariotas. Son parásitos obligados que no capacidad metabólica y con el fin de replicar, se basan sobre el metabolismo del huésped para producir piezas virales que uno mismo-montan dentro de las células del huésped.
Los virus son ultramicroscópicos, demasiado pequeños para ser vistos con el microscopio de luz, visible sólo con la mayor resolución del microscopio electrónico. Una partícula viral consiste en un genoma de ácido nucleico, DNA o RNA, rodeado por una cubierta proteica, denominada cápside, compuesta por subunidades proteicas o capsómeros. En algunos virus más complejos, la cápside está rodeada por una envoltura de lípidos adicionales, y algunas tienen apéndices superficiales espiga o cola.
Virus que infectan el tracto intestinal de humanos y animales son conocidos como virus entéricos. Son excretados en las heces y puede ser aislados de las aguas residuales domésticas. Virus que infectan bacterias se denominan bacteriófagos, y los que infectan a las bacterias coliformes se llaman colífagos (figura 1). Los fagos de las bacterias coliformes se encuentran en cualquier lugar se encuentran las bacterias coliformes.
Figura 1. Colifago T2.
Principles
Bacteriófagos son estudiados en ciencias ambientales porque son un componente crítico de los sistemas biológicos. Son la entidad biológica más abundante en la tierra y son importantes ya que ayudan a controlar las poblaciones bacterianas, procesos tróficas, ciclos biogeoquímicos, así como mejoran la diversidad procariótica a través transferencia horizontal del gene. También hay evidencia de que los phages son indicadores sustitutos confiables para virus entéricos patógenos también heces-transmitidos pero difícil de ensayo. La disponibilidad de métodos relativamente rápidas y baratas para enumerar los bacteriófagos los hace una herramienta atractiva para la evaluación de contaminación fecal en muestras ambientales.
Se analizan colífagos en agua por la adición de una muestra suave o un agar de recubrimiento junto con una cultura de e. coli en la fase logarítmica de crecimiento. El phage de la una a la célula bacteriana y lisar las bacterias. Las bacterias producen un césped confluente de crecimiento excepto en áreas donde el fago ha crecido y lisis de las bacterias. Estas áreas claras resultantes se conocen como placas. Un recubrimiento de agar suave se utiliza para restringir la difusión física de los virus para que, con lisis de una bacteria, sólo puede propagarse a los vecinos las células bacterianas.
Para obtener la formación de placa óptima es importante que la bacteria del anfitrión es en la etapa de registro de crecimiento. Esto asegura que el fago fije para vivir bacterias y producir progenie. Esto requiere que un cultivo de bacterias de acogida preparada cada día en que se realice un ensayo. Por lo general, una cultura se incuba el día antes de la prueba para que se haga en la fase estacionaria. En el día del ensayo, la cultura se utiliza para inocular un caldo, que se incuba para obtener suficientes bacterias de anfitrión en la fase de registro para el ensayo (esto generalmente requiere 2-3 h de incubación en un baño a 35-37 ° C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
- Obtener una muestra de aguas residuales o aguas que contienen colifago.
- Diluir la muestra 1:10 y 1: 100 utilizando tampón Tris. Para ello, transferir 1,0 mL de cultivo a 9 mL de tampón Tris y luego hacer una dilución de 10 veces en segundo lugar.
- Fundir los tres tubos de agar blando (0,7% de agar nutritivo o agar de soja trypticase por tubo de 3 mL) colocándolos en un baño de vapor o autoclave.
- Ponga el agar en un baño de agua a 45-48 ° C por 15 min para permitir que la temperatura del agar a 45 ° C.
- Al primer tubo agregar 1 mL de un cultivo en caldo fase log de e. coli1 y 1 mL de muestra sin diluir.
- Retire el tubo del baño de agua y suavemente roca entre las manos para mezclar la suspensión de s de 2-3.
- Limpie el agua del tubo con una toalla de papel y verter el agar en una placa Petri previamente preparadas que contienen agar base (agar nutritivo regular o agar de soja trypticase).
- Gire rápidamente la placa para difundir el agar superior. Asegúrese de que el agar cubre toda la superficie.
- Repita los pasos 5-8 con los otros dos tubos de agar blando, utilizando 1 mL de bacterias y 1 mL de cada dilución de la muestra (figura 2).
- Después de que se haya solidificado el agar, invertir las cajas Petri e incubar a 37 ° C por 48 h. golpee cualquier humedad de la tapa de la caja Petri. Si cae una gota de humedad en una placa hará que el virus se propague en toda la superficie del agar.
- Después de la incubación, cuente el número de placas en cada dilución (figura 3) y calcular la concentración de fagos en la muestra original. Anotar las principales diferencias en el tamaño o aspecto de las placas.
Figura 2. Procedimiento para la preparación de un césped bacteriano usando top agar para el recuento de colifago.
Figura 3. Placas de fagos sobre un césped bacteriano.
1 Cepa de e. coli ATCC 15597 generalmente produce el mayor número de placas de muestras de aguas residuales. Se debe cultivar durante la noche en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya e incubados bajo condiciones de agitación a 35 ° C. 3 h antes del ensayo de fago inocular 1 mL de esta cultura en un fresco frasco que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya y el lugar en un baño a 35-37 ° C. Esto asegurará que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento.
Los virus son partículas biológicas infecciosas que son responsables de muchas enfermedades, el frío y la gripe, la hepatitis y el VIH.
Los virus son partículas biológicas consisten en un DNA o RNA genoma, envuelto dentro de una cubierta proteica denominada cápside, a veces con una envoltura de lípidos adicionales. Virus no tiene sus el propios, capacidad metabólica o reproductiva y deben invadir células vivas y secuestrar su maquinaria celular para hacer más copias de sí mismos.
Las células procariotas, como las bacterias y células eucariotas, como las de los seres humanos, pueden ser infectadas por clases específicas de virus. Específicamente, los bacteriófagos son virus que infectan bacterias. Por ejemplo, los colífagos son los fagos que infectan a e. coli, una bacteria común del intestino, algunas cepas que pueden causar intoxicación alimentaria, y que es una indicación de contaminación fecal en el suministro de agua.
Mientras que los fagos no se conocen generalmente a ser patógeno en seres humanos, existen evidencias que son indicadores de sustituto fiable para patógenos enterovirus también heces-transmitidos pero difícil de analizar. La disponibilidad de métodos relativamente rápidas y baratas para enumerar los bacteriófagos los hace una herramienta atractiva para la evaluación de contaminación fecal en muestras ambientales.
Este video presenta los principios detrás de enumeración de fagos; demostrar un protocolo para la cuantificación de phages, conocidos como el ensayo de placa; y por último, explorar varias aplicaciones de la ciencia ambiental para la detección y recuento de fagos y otros virus.
Bacteriófagos, como todos los virus, deben parasitar las células vivas, en este caso las bacterias, con el fin de reproducir.
Los phages hacen aterrizar y fijación a la superficie de la célula bacteriana e inyectar su material genético en la célula. Una vez dentro de la célula, el genoma viral se replica y se producen los componentes de la proteína de la cápside viral, ambos utilizando la maquinaria bioquímica de la célula huésped. Una vez que las partículas de fagos se ensamblan, se lanzan de las bacterias, a menudo por lisis del host y estalla, matando a la célula huésped en el proceso.
Un método ampliamente utilizado para la determinación de la concentración de fagos en una muestra aprovecha esta actividad lítica. En esta técnica, el phage de la muestra se mezcla con las bacterias y agar suave. Esta mezcla se vierte en placas de Petri con agar regular como un sustrato y las formas de la capa superior un recubrimiento.
Las bacterias son en una alta concentración que forman un césped permanente. La bacteria debe obtenerse de la cultura que está en la fase logarítmica de crecimiento, para asegurar que cada bacteria que infecta a los phages está viva y permite el phage producir progenie.
Cuando una partícula de fago infecta y descompone mediante lisis de una bacteria, la progenie del fago se extendió a cerca de las células bacterianas y continuar con la infección. El agar blando restringe la difusión de las partículas de fago. Finalmente, se formará una zona de claro, conocida como una placa.
Si el fago se diluye a una concentración lo suficientemente baja, las placas discretas, individuales pueden observarse en el césped bacteriano. Estos pueden ser contados y permite calcular el número de unidades formadoras de placa o PFUs de fagos por mL de la muestra original.
Ahora que usted entiende cómo fagos infectan a las bacterias y cómo esta actividad se puede utilizar para medir la concentración de fagos, vamos a ir a través de un protocolo para el uso de un ensayo de placa para enumerar los phages en muestras de agua ambiental.
Un día antes de realizar el ensayo, inocular una colonia de la cepa de e. coli ATCC 15597 en 100 mL de caldo de soja tripticasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Incubar con agitación a 35 ° C durante la noche.
3 h antes del ensayo, inocular 1 mL de la cultura de e. coli durante la noche en una fresca 100 mL de caldo. Coloque esta nueva cultura en un baño a una temperatura entre 35 y 37 ° C. Esto asegura que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento cuando el ensayo comienza.
Para iniciar el ensayo de placa, hacer 10 y 100 veces diluciones seriadas de la muestra de agua, con 9 mL de tampón Tris.
Utilizando un baño de vapor, derrita tres tubos 5 mL de agar superior suave del 0,7%, o agar trypticase de soja o de nutrientes. Una vez derretido, colocar en un baño de agua a 45 a 48 ° C durante al menos 15 min para que baje a 45 ° C. temperatura de agar
Al primer tubo de agar blando, añadir 1 mL de la fase logarítmica previamente preparada cultura de e. coli y 1 mL de la muestra de agua sin diluir. Retire el tubo del baño de agua y suavemente roca entre sus manos para 2-3 s mezclar la suspensión.
Verter el agar suave sobre una placa de Petri previamente preparado con agar trypticase de soja o nutrientes. Rápidamente gire la placa de la extensión, asegurándose de que cubra toda la superficie.
Repetir la inoculación y placas para los otros dos tubos, 1 ml de cada una de las muestras diluidas.
Una vez que se ha solidificado el agar superior, invertir los platos e incubar a 37 ° C durante 48 h.
Después de la incubación, cuente el número de plagas en cada plato. De la cuenta, calcular la concentración de fagos en la muestra original
Por ejemplo, si 9 placas se obtuvieron de la placa de la dilución de 10 veces, entonces hay 9 veces 10 dividido por 1 mL, o 90 PFUs/mL de colifago en la muestra original de agua.
Ahora que usted ha visto cómo se realizan los ensayos de placa de fago, echemos un vistazo a cómo ensayos de placa se pueden utilizar para enumerar los fagos y otros tipos de virus de una variedad de fuentes.
Método basado en el ensayo de placa se puede utilizar para aislar bacteriófago de diversas muestras ambientales como suelo. En este ejemplo, los investigadores primero recogen phage del suelo por filtración. El phage entonces fue utilizado para infectar a las bacterias comunes Arthrobacter del suelo en un ensayo de placa. Phages fueron recogidos de las placas individuales trata nuevas placas de agar y entonces overlaid con agar superior que contiene las bacterias. Concentración de fagos disminuye a lo largo de la longitud de la racha, de modo que pudieran obtenerse placas circunscritas, probablemente formadas por un solo tipo de fago. Estas placas individuales podrían ser recogidas entonces analizar los phages dentro.
Además de bacteriófagos, ensayos de placa también puede realizarse con otros virus, incluyendo aquellas que, como la gripe, que infecta a mamíferos. Para hacer esto, las células mamíferas son primero crecidas para arriba como monocapas en platos de cultivo de tejidos. Medios que contienen los virus se añaden a las células para permitir que la infección ocurra, antes de que las células son overlaid con un medio de inmovilización como la agarosa gelatinoso. Después de un período de incubación que puede durar hasta dos semanas, las células infectadas son fijo y teñidas para permitir que las placas ser visualizados y contado.
Finalmente, además de las muestras recogidas del medio ambiente, ensayos de placa son útiles para la detección y enumeración de virus en muestras de tejido de individuos infectados. Aquí, los investigadores obtuvieron y tejidos homogeneizados de pulmón de ratones infectaron con gamma-herpesvirus. Este homogeneizado que contiene el virus entonces fue utilizado para infectar cultivos celulares mamíferos. El número de placas entonces podría contarse proporcionar una estimación de la concentración viral en los tejidos pulmonares infectados.
Acabo de ver video de Zeus en la detección de bacteriófagos en muestras ambientales. Ahora debería entender la biología básica de phages, cómo realizar un ensayo de placa para cuantificar phages en una muestra ambiental y cómo se pueden utilizar ensayos de placa para el estudio de fagos y otros virus en muestras clínicas o ambientales. ¡Como siempre, gracias por ver!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Dilución de muestras de aguas residuales = 10-1
Número de placas obtenidas = 9
Por lo tanto, la concentración de fagos en muestra de aguas residuales
= 10 x 9 ÷ 1 mL
= 90 unidades formadoras de placas / mL
Aguas residuales normalmente contienen 103 – 104 colifago por mL, con una gama de 102 – 108 / mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Hay muchas aplicaciones potenciales de colífagos como indicadores ambientales. Estos incluyen su uso como indicadores de contaminación de las aguas residuales, eficiencia de agua y tratamiento de aguas residuales y la supervivencia de virus entéricos y bacterias en el medio ambiente. El uso de bacteriófagos como indicadores de la presencia y comportamiento de las bacterias entéricas y virus animal siempre ha sido atractivo debido a la facilidad de detección y bajo costo relacionados con phage ensayos. Además, puede cuantificarse en muestras ambientales dentro de las 24 h en comparación con días o semanas en busca de virus entéricos.
1 Cepa de e. coli ATCC 15597 generalmente produce el mayor número de placas de muestras de aguas residuales. Se debe cultivar durante la noche en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya e incubados bajo condiciones de agitación a 35 ° C. 3 h antes del ensayo de fago inocular 1 mL de esta cultura en un fresco frasco que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya y el lugar en un baño a 35-37 ° C. Esto asegurará que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
